للتحقيق في الجوانب البيولوجية للأنسجة الدهنية البنية ، من الضروري إزالة الحجم الدهني البني النقي. حاليا لا يأتي في تنقية حجم الدهون البني والكتل متوفرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول مباشر لمعالجة هذه المشكلة.
الآن ، هناك حاجة إلى مهارات واحدة لهذا البروتوكول. يحتاج إلى مواد دراسة أقل بكثير من الطرق الأخرى ويمكن استخدام الحجم الدهني البني المنقى مباشرة لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. يوفر هذا البروتوكول طريقة جديدة لدراسة بيولوجيا الحجم الدهني البني الكلاسيكي.
ويمكن أيضا أن تطبق لدراسة عملية تحمير الخلايا الشحمية البيضاء. ستوضح الإجراء أماندا ، مساعدة أبحاث من مختبري. ابدأ بوضع القارورة مع BAT ومحلول الهضم على محرك مغناطيسي بمعدل 60 دورة في الدقيقة في حاضنة 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
استخدم ماصة ملليلتر واحد لتعطيل كتل الأنسجة المجمعة لشرائح BAT حول شريط التقليب. بعد الهضم ، ضع مرشح مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر وماصة حول أربعة ملليلتر من تعليق الخلية عبر المصفاة. ثم اغسله بأربعة ملليلتر من محلول يوديكسانول 12٪.
ماصة لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا بمحلول اليوديكسانول ثم نقل خليط الخلية إلى أنبوبي اختبار بوليسترين شفافين سعة خمسة ملليلتر. ضع أنابيب البوليسترين التي تحتوي على خليط الخلايا على الثلج لمدة ساعة واحدة، مما يتسبب في تكوين طبقة على القمة. أخرج 20 ميكرولترا من BAs المعزولة لفحص المجهر.
لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين ، ماصة طبقة BA في أنبوبين microcenterfuge 1.7 ملليلتر. ثم قم بإزالة محلول اليوديكسونال المفرط بعناية دون تعطيل طبقة BA. ثم أضف ملليلترا واحدا من TRIzol إلى محلول الخلية لعزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين في وقت واحد واخلطه بشكل كاف لتقطيع الخلايا.
لفصل المراحل ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم وأجهزة الطرد المركزي إلى الأنبوب عند 9،981 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، استخدم المرحلة المائية لعزل الحمض النووي الريبي. انقل 300 ميكرولتر من المرحلة العضوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر وأضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
بعد الدوامة لمدة 10 ثوان ، أضف 200 ميكرولتر من 1-برومو-3-كلوروبروبان ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثوان. أضف 600 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج قبل الدوامة لمدة 10 ثوان. دع المحلول المختلط يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي ، أضف 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. سيتم فصل المراحل مع مرحلة البروتين المترجمة في الطبقة الوسطى. قم بإزالة المحلول المائي العلوي وأضف ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المحلول المتبقي.
بعد الطرد المركزي عند 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪. أجهزة الطرد المركزي في 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، جفف الحبيبات في الهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بقياس وزن الحبيبات الرطبة.
أضف محلول SDS بنسبة 1٪ 20 ميكرولتر لكل ملليغرام من الحبيبات. قم بإذابة الحبيبات تماما عن طريق وضع الأنبوب في شاكر ساخن عند 55 درجة مئوية و 11 جم لمدة خمس إلى 10 دقائق. في البروتوكول ، تم استخدام PBS الذي يحتوي على 3٪ BSA لفصل BAs عن BAT.
كانت الخلايا المعزولة على شكل توت العليق مع قطرات دهنية متعددة العين بداخلها وكانت إيجابية tdTom ، مما يؤكد أنها كانت BAs. تم عزل البروتين من BAs باستخدام بروتوكول GTPC محسن ثم تم فحصه باستخدام هلام SDS-PAGE. لوحظ وجود نطاق مهيمن مرتبط ب BSA في عينة BA ، مما يشير إلى تداخله في استخراج البروتين.
لتجنب تداخل BSA ، تم استخدام محلول يوديكسونال 6٪ لعزل BAs ، والتي كان لها شكل توت نموذجي وتحتوي على قطرات دهنية متعددة العينات. تم فصل البروتينات المستخرجة من هذه BAs جيدا في هلام SDS-PAGE. تم العثور على هذه الخلايا لتكون tdTomato إيجابية في حين أن الخلايا المستعادة من الحبيبات كانت tdTomato سلبية مع عدم وجود قطرات دهنية واضحة ، مما يشير إلى الفصل الفعال ل BAs من الخلايا غير الدهنية.
في تحليل التعبير الجيني ، كانت مستويات mRNA ل UCP1 و PDGFA أعلى بكثير في BAs المعزولة. ولكن تم اكتشاف mRNA من PDGFRA فقط في BAT. تم العثور على بروتين UCP1 المخصب في BAs معزولة.
تم الكشف عن EDGFR alpha في أفضل التقنيات المتاحة ، ولكن ليس في BAs المعزولة. تؤكد هذه النتائج كفاءة طريقة عزل BAs وتثبت أن BAs المعزولة مناسبة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. عند محاولة هذا البروتوكول ، استخدم مخزن هضم طازج لفصل الأنسجة الدهنية البنية وتجنب تكوين كتلة الأنسجة خلال فترة الهضم.
هذه الطريقة الجديدة تجعل من السهل التحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية البنية على مستوى صنبور خلية واحدة. من خلال تطبيق هذه الطريقة ، يمكن للمرء إجراء دراسات تعبير GN والبروتين باستخدام الخلايا الشحمية البنية النقية التي تشريح بدقة برنامج التعبير الجيني للخلايا الشحمية البنية ، دون القلق بشأن التلوث في الأصل من الخلايا غير الدهنية.
