يصف هذا البروتوكول تحضير واستخدام أجنة الدجاج بين اليوم الخامس والثامن من الحضانة للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين ودراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة تسمح الطرق الثلاث لإخراج المحتوى من قشرة البيضة في اليوم الخامس إلى الثامن بتطوره داخل القشرة ولا تتطلب سوى أدوات المختبر الأساسية. هذا النموذج مناسب للتحقيق في جوانب مختلفة من أبحاث الموجات فوق الصوتية والأوعية الدموية مثل تصوير تدفق الدم ، وتوصيل الدواء ، وعوامل التباين ومحولات الطاقة الجديدة بالموجات فوق الصوتية. لتحضير جنين يبلغ من العمر خمسة أيام ، ضع بويضة مخصبة محتضنة لمدة خمسة أيام في حامل بيض تم تسخينه مسبقا مع البويضة في نفس الاتجاه كما هو الحال داخل الحاضنة واستخدم الواجهة الخلفية المدببة لطرف الملقط لعمل مسافة بادئة صغيرة في الجزء العلوي من البويضة.
استخدم الملقط لعمل مسافة بادئة ثانية على جانب البيضة حوالي 2/3 أسفل طول البيضة واستخدم زوجا من الملقط الأكبر لإزالة قطعة صغيرة من قشر البيض من المنطقة ذات المسافة البادئة في الجزء العلوي من البيضة ، مع الحرص على أن يتلامس كيس الهواء مع الهواء المحيط دون اختراق القشرة بعمق شديد. باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 19 ، تخترق القشرة من خلال المسافة البادئة الثانية مع توجيه الإبرة إلى أسفل وسحب ما يقرب من ملليلتر من الألبومين. عندما يتم جمع الألبومين ، استخدم الشريط اللاصق لإغلاق الثقب وتوزيع الألبومين في قارب وزن.
استخدم الملقط الكبير لتكبير الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى البويضة حتى يصبح الجنين والغشاء المشيمي الميلانتوي مرئيين تماما دون إزالة القشرة الموجودة أسفل الغشاء المشيمي أو اختراق الغشاء الداخلي. عندما يتم إنشاء فتحة كافية ، أدر البيضة 180 درجة داخل الحامل بحيث تكون الفتحة الموجودة في الجزء العلوي من البيضة متجهة الآن نحو القاع. بعد دقيقة إلى دقيقتين ، سوف يطفو الجنين لأعلى ، ويصبح غير مرئي من الأسفل.
عندما يختفي الجنين بأكمله والغشاء المشيمي من الأنظار ويكون صفار البيض فقط مرئيا ، قم بإزالة الشريط من الفتحة الجانبية. يجب أن ينتفخ الجزء الداخلي من البيضة من الفتحة. أثناء إمساك قاع البيضة بالقرب من وعاء الوزن في حامل قارب الوزن المعدني ، استخدم النقاط الحادة للملاقط الصغيرة لعمل خدش أفقي برفق ولكن بسرعة في الغشاء على كامل عرض الفتحة وقم بإسقاط محتويات البيض برفق في وعاء الوزن.
تحقق مما إذا كانت نبضات القلب لا تزال موجودة للتأكد من أن الجنين لا يزال على قيد الحياة ، وأن الأوعية الغشائية المشيمية سليمة ، ولا يوجد تسرب للدم أو صفار البيض. ضع الجنين القابل للحياة عند 37 درجة مئوية مع الإدارة المنتظمة لقطرات 30 ميكرولتر من 37 درجة مئوية PBS إلى الجنين والغشاء المشيمي. لحصاد جنين عمره ستة إلى سبعة أيام وغشاء مشيمي آلانتويك ، قم بإعداد البويضة كما هو موضح لجنين عمره خمسة أيام واستخدم حقنة جديدة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 19 لاختراق القشرة من خلال المسافة البادئة الثانية مع توجيه الإبرة لأسفل لسحب خمسة إلى ستة ملليلتر من الألبومين في اختراق واحد.
عندما يتم جمع الألبومين ، أدخل إبرة حقنة سعة 10 ملليلتر تحتوي على ما يقرب من ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية PBS ، أكثر من الحجم المسحوب ، في جانب القشرة مع توجيه الإبرة لأسفل لتحل محل الألبومين المحصود. بعد ذلك ، أعد سد الفجوة بسرعة بقطعة من الشريط وانتهي من معالجة البويضة كما هو موضح. لحصاد الجنين والغشاء المشيمي من بويضة مخصبة عمرها ثمانية أيام ، أمسك البويضة أفقيا ، واستخدم الطرف الخلفي لزوج من الملقط الكبير ، وقم بعمل مسافة بادئة صغيرة في منتصف الطريق تقريبا على طول البويضة.
قم بعمل مسافات بادئة صغيرة في نمط حلقة 360 درجة حول مساحة قشرة البيضة على بعد حوالي 10 ملليمترات. عندما يتم إنشاء جميع المسافات البادئة ، استخدم الطرف المدبب للملاقط لكسر القشرة بين اثنتين من المسافات البادئة وغمر البيضة تماما في برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، حرك البيضة فوق قارب وزن في PBS وضع كلا الإبهام في الفتحة الكبيرة لفتح البيضة برفق ، والتي يجب أن تتشقق على طول المسافات البادئة الصغيرة.
عندما يتشكل الشق حول قشرة البيضة ، اسحب الجانبين برفق بعيدا ، مع تحريك القطع برفق ذهابا وإيابا حتى يتم فصل محتويات البيضة عن القشرة وإسقاط المحتويات في قارب الوزن. ارفع ببطء قارب الوزن الذي يحتوي على محتويات البيض من PBS ، مع إمالة قارب الطريق قليلا لإزالة أي PBS زائد. ثم ضع قارب الوزن في حامل قارب وزن معدني.
في هذه المرحلة ، يمكن رؤية القلب النابض في الجنين. لتحضير عينة من غشاء الجنين والمشيمية للتصوير المجهري ، ضع حاملا بغشاء صوتي مع أغاروز في قاع طبق بتري واحد يحتوي على حوالي 500 ملليلتر من PBS 37 درجة مئوية مع طبقة الأغاروز متجهة لأعلى. استخدم مقصا صغيرا لقطع غشاء vitellus بسرعة في ست إلى سبع جروح حول الغشاء المشيمي اللانتوي بالكامل أثناء تدوير قارب الوزن للحصول على دقة وسرعة أفضل.
استخدم ملعقة كبيرة لغرف الغشاء المقطوع الذي يحتوي على الجنين والغشاء المشيمي الآلانتويك وارفع الملعقة ببطء للسماح بالفحص البصري لما إذا كان الغشاء المقطوع الذي يحتوي على الجنين والغشاء المشيمي لا يزال متصلا بما تبقى من غشاء كيس الصفار. قم بإمالة الملعقة قليلا للتخلص من أكبر قدر ممكن من صفار البيض دون تجفيف الأنسجة وغمر الغشاء المقطوع في PBS في طبق بتري سعة لتر واحد. باستخدام ملاقط صغيرة ، أمسك بحافة واحدة من الغشاء وقم بتحريكها برفق لإزالة أي صفار لا يزال متصلا قبل تحريك الغشاء فوق الحامل بالغشاء الصوتي.
استخدم دبوس عينة الحشرات لتأمين الغشاء في الزوايا المقابلة للحامل وتجنب ثقب أوعية الغشاء المشيمي. عندما يتم تأمين كلا الزاويتين ، ارفع الحامل وقم بإمالته قليلا للتخلص من معظم PBS واستخدم الملقط الصغير لتمديد الغشاء وتوزيعه بالتساوي على الحامل للسماح بتثبيت بقية الغشاء بشكل مسطح على الحامل. عندما يتم تأمين الجنين ، ضع الحامل في إعداد الفحص المجهري عند 37 درجة مئوية وضع غشاء شفاف صوتيا وبصريا فوق المنطقة محل الاهتمام على العينة للسماح بالتصور البصري للأوعية.
في هذا التحليل التمثيلي ، تمت إزالة خمسة وستة وسبعة وثمانية أجنة وأغشية مشيمية ألانتويك عمرها خمسة وستة وسبعة وثمانية أيام كما هو موضح. لا يمكن ملاحظة أي نزيف أو تلف في الأجنة أو الأغشية المشيمية ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه الطرق لحصاد محتوى البويضة بأمان دون الإضرار بالجنين أو الأوعية الغشائية المشيمية الآلانتويك. يمكن أن تحدث مضاعفات متعددة أثناء الاستخراج ، لذلك من المهم اتباع البروتوكول بعناية وتجاهل أي عينات من الأنسجة التالفة.
كما هو موضح ، يمكن حقن الجنين ، على سبيل المثال ، بعوامل تباين الموجات فوق الصوتية مثل الفقاعات الدقيقة. عند الولادة ، يمكن ملاحظة الفقاعات الدقيقة التي تدور داخل تجويف الأوعية الدموية المحقونة وتدور داخل الدم المحيطي لعدة ساعات. قبل حقن الفقاعات الدقيقة ، يمكن بالفعل ملاحظة التباين داخل القلب الجنيني عن طريق الوضع B ، ولكن ليس التصوير شبه التوافقي بالموجات فوق الصوتية عالي التردد.
تزيد إضافة الفقاعات الدقيقة من تباين الجنين ورؤيته في كلا النوعين من الصور. يمكن أيضا الحصول على صور شبه توافقية 3D عالية التردد بعد حقن عامل التباين لتصور شبكات الأوعية داخل الجنين والغشاء المشيمي. يمكن أيضا استخدام جنين الدجاج والأوعية الغشائية المشيمية للتحقيق في توصيل الدواء بوساطة الموجات فوق الصوتية.
عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم للغاية الحفاظ دائما على الجنين و CAM عند 37 درجة مئوية وعدم تركه يجف. بعد هذا الإجراء ، يمكن وضع جنين الدجاج في إعدادات مختلفة ، مثل خزان المياه أو المجهر لإجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين أو دراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة. هذه الطريقة والتحضير مناسبة لدراسات عامل التباين بالموجات فوق الصوتية ويمكن استخدامها أيضا في أبحاث السرطان والفيروسات.
