该协议描述了孵化第五天至第八天之间鸡胚胎的制备和使用，用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送研究 在第五至第八天从蛋壳中取出内容物的三种方法允许其在蛋壳内发育，只需要基本的实验室工具。该模型适用于研究超声和血管研究的不同方面，如血流成像、药物输送以及新的超声造影剂和换能器。要准备五天大的胚胎，请将五天孵化的受精卵放入预热的蛋架中，鸡蛋的方向与培养箱内的方向相同，并使用镊子尖端的尖头在蛋的最顶部做一个小凹痕。
使用镊子在鸡蛋侧面沿着鸡蛋长度向下约 2/3 处做第二个凹痕，并使用一对较大的镊子从鸡蛋顶部的凹陷区域去除一小块蛋壳，注意气囊与周围空气接触而不会太深地穿透蛋壳。使用配备 19 号针头的 5 毫升注射器通过第二个压痕穿透外壳，针头指向下方并提取大约 2 毫升白蛋白。收集白蛋白后，使用胶带密封穿刺并将白蛋白分配到称重舟中。
使用大镊子扩大鸡蛋顶部的小开口，直到胚胎和脉络膜尿囊膜完全可见，而无需去除脉络膜尿囊膜下方的壳或穿透内膜。当创建足够的开口后，在支架内将鸡蛋旋转 180 度，使鸡蛋顶部的开口现在朝向底部。一到两分钟后，胚胎会漂浮起来，从底部变得不可见。
当整个胚胎和脉络膜尿囊膜从视野中消失并且只看到蛋黄时，从侧开口取下胶带。鸡蛋的内部应该从开口处凸出。在金属称重舟架中将鸡蛋底部靠近称重船的同时，使用小镊子的尖头在开口的整个宽度上轻轻但快速地在膜上划痕，然后将鸡蛋内容物轻轻地放入称重舟中。
检查心跳是否仍然存在，以确认胚胎还活着，脉络膜尿囊血管完整，没有血液或蛋黄泄漏。将活胚胎置于37摄氏度，定期向胚胎和脉络膜尿囊膜施用30微升37摄氏度PBS。要收获六到七天大的胚胎和脉络膜尿囊膜，按照五天大的胚胎的证明准备卵子，并使用配备 19 号针头的新型 5 毫升注射器通过第二个压痕穿透壳，针头朝下以在一次穿透中取出 5 到 6 毫升白蛋白。
收集白蛋白后，将含有约1毫升37摄氏度PBS的10毫升注射器的针头插入壳的侧面，针头朝下以替换收获的白蛋白。然后，用胶带快速重新密封间隙，并按照演示完成对鸡蛋的处理。要从八天大的受精卵中收获胚胎和脉络膜尿囊膜，请水平握住卵子，使用一对大镊子的后端，并在卵子长度的一半左右做一个小凹痕。
在蛋壳空间周围以 360 度的环形图案做小凹痕，相距约 10 毫米。创建所有压痕后，使用镊子的尖头打开两个凹痕之间的壳，然后将鸡蛋完全浸入 37 摄氏度的 PBS 中五分钟。在孵化结束时，将鸡蛋移到PBS中的称重船上，并将两个拇指放入大孔中以轻轻打开鸡蛋，鸡蛋应该沿着小凹痕破裂。
当蛋壳周围形成裂缝时，轻轻地将两侧拉开，同时轻轻地来回移动块，直到蛋内容物与蛋壳分离并将内容物放入称重船中。慢慢抬起装有PBS中鸡蛋内容的称重船，稍微倾斜船以去除任何多余的PBS。然后，将秤船放入金属称重舟架中。
在这个阶段，可以在胚胎中看到跳动的心脏。为了制备用于显微镜成像的胚胎和脉络膜尿囊膜样品，请将带有琼脂糖声膜的支架放在含有约 500 毫升 37 摄氏度 PBS 的一窝培养皿的底部，琼脂糖层朝上。使用小剪刀在整个绒毛膜尿囊膜周围快速切入髖骨膜，进行六到七次切割，同时旋转称重船以获得更好的精度和速度。
用一汤匙舀起含有胚胎和绒毛膜尿囊膜的切口膜，然后慢慢抬起勺子，以便目视检查含有胚胎和绒毛膜尿囊膜的切口膜是否仍然附着在蛋黄囊膜的其余部分。稍微倾斜勺子以去除尽可能多的蛋黄，而不会使组织变干，并将切口膜浸入 PBS 中的一升培养皿中。使用小镊子，抓住并轻轻旋转膜的一个边缘以去除仍然附着的任何蛋黄，然后再将膜移动到带有声膜的支架上。
使用昆虫标本别针将膜固定在支架的相对角上，避免刺穿脉络膜尿囊膜血管。固定好两个角后，抬起并稍微倾斜支架以丢弃大部分PBS，并使用小镊子拉伸膜并将其均匀分布在支架上，以使膜的其余部分平放在支架上。当胚胎被固定后，将支架放入37摄氏度的显微镜设置中，并在样品的感兴趣区域上放置一个声学和光学透明的膜，以允许容器的光学可视化。
在这项代表性分析中，如图所示，去除了五天、六天、七天和八天的胚胎和脉络膜尿囊膜。没有观察到胚胎或脉络膜尿囊膜出血或损伤，表明这些方法可用于安全地收获卵子内容物，而不会伤害胚胎或脉络膜尿囊膜血管。提取过程中可能会出现多种并发症，因此仔细遵循方案并丢弃任何受损的组织样本非常重要。
如所证明的，胚胎可以注射例如超声造影剂，例如微泡。分娩时，可以观察到微气泡在注射血管的管腔内循环并在外周血内循环数小时。在微泡注射之前，已经可以通过B模式在胚胎心脏内观察到对比，但不能通过高频超声次谐波成像观察到对比。
微气泡的添加增加了胚胎在两种类型图像中的对比度和可见性。注射造影剂后还可以获得高频3D次谐波图像，以可视化胚胎和脉络膜内的血管网络。鸡胚和脉络膜尿囊膜血管也可用于研究超声介导的药物递送。
尝试此过程时，最重要的是始终将胚胎和CAM保持在37摄氏度，并且不要让它变干。按照此过程，可以将鸡胚胎放置在不同的设置中，例如水箱或显微镜，以进行对比增强超声成像或微泡介导的药物递送研究。该方法和制剂适用于超声造影剂研究，也可用于癌症和病毒研究。
