Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtım çalışmaları için kuluçkanın beşinci ila sekizinci günleri arasında tavuk embriyolarının hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklar İçeriği beş ila sekizinci günde yumurta kabuğundan çıkarmak için üç yöntem, kabuk içinde gelişmesine izin verir ve sadece temel laboratuvar araçlarını gerektirir. Bu model, kan akımı görüntüleme, ilaç dağıtımı ve yeni ultrason kontrast maddeleri ve dönüştürücüleri gibi ultrason ve vasküler araştırmaların farklı yönlerini araştırmak için uygundur. Beş günlük bir embriyo hazırlamak için, beş günlük inkübe döllenmiş bir yumurtayı, yumurtayı inkübatörün içindekiyle aynı yönde olacak şekilde önceden ısıtılmış bir yumurta tutucuya yerleştirin ve yumurtanın en üstünde küçük bir girinti yapmak için cımbız ucunun sivri uçlu arka ucunu kullanın.
Yumurtanın yan tarafında yumurtanın uzunluğunun yaklaşık 2 / 3'ü kadar ikinci bir girinti yapmak için cımbız kullanın ve hava kesesinin kabuğa çok derin nüfuz etmeden ortam havasıyla temas etmesine dikkat ederek, yumurtanın üstündeki girintili alandan küçük bir parça yumurta kabuğunu çıkarmak için bir çift daha büyük cımbız kullanın. 19 gauge'luk bir iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanarak, iğne aşağı doğru işaret ederek ikinci girintiden kabuğa nüfuz eder ve yaklaşık iki mililitre albümin çeker. Albümin toplandığında, delinmeyi kapatmak için bant kullanın ve albümini bir tartım teknesine dağıtın.
Korioallantoik membranın altındaki kabuğu çıkarmadan veya iç zara nüfuz etmeden embriyo ve koryoallantoik membran tamamen görünene kadar yumurtanın üstündeki küçük açıklığı büyütmek için büyük cımbızları kullanın. Yeterli bir açıklık oluşturulduğunda, yumurtayı tutucunun içinde 180 derece çevirin, böylece yumurtanın üstündeki açıklık şimdi tabana doğru bakacak şekilde döndürülür. Bir ila iki dakika sonra, embriyo yukarı doğru yüzecek ve alttan görünmez hale gelecektir.
Tüm embriyo ve koryoallantoik membran görünümden kaybolduğunda ve sadece yumurta sarısı göründüğünde, bandı yan açıklıktan çıkarın. Yumurtanın içi açıklıktan dışarı çıkmalıdır. Metal tartım teknesi tutucusunda yumurtanın tabanını tartım teknesine yakın tutarken, küçük cımbızların keskin noktalarını kullanarak açıklığın tüm genişliği boyunca zarda nazikçe ama hızlı bir şekilde yatay bir çizik yapın ve yumurta içeriğini yavaşça tartım teknesine bırakın.
Embriyonun hala hayatta olduğunu, koryoallantoik membran damarlarının sağlam olduğunu ve kan veya yumurta sarısı sızıntısı olmadığını doğrulamak için kalp atışının hala mevcut olup olmadığını kontrol edin. Canlı embriyoyu, embriyoya ve koryoallantoik membrana düzenli olarak 37 santigrat derece PBS'lik 30 mikrolitrelik damla 37 santigrat dereceye yerleştirin. Altı ila yedi günlük bir embriyoyu ve koryoallantoik zarı hasat etmek için, yumurtayı beş günlük bir embriyo için gösterildiği gibi hazırlayın ve ikinci girintiden kabuğa nüfuz etmek için 19 gauge iğne ile donatılmış yeni bir beş mililitrelik şırınga kullanın.
Albümin toplandığında, yaklaşık bir mililitre 37 santigrat derece PBS içeren 10 mililitrelik bir şırınganın iğnesini, çekilen hacimden daha fazla, hasat edilen albümini değiştirmek için iğne aşağı doğru bakacak şekilde kabuğun yanına yerleştirin. Ardından, boşluğu bir bant parçasıyla hızlı bir şekilde yeniden kapatın ve yumurtayı gösterildiği gibi işlemeyi bitirin. Embriyoyu ve koryoallantoik zarı sekiz günlük döllenmiş bir yumurtadan toplamak için, yumurtayı yatay olarak tutun, bir çift büyük cımbızın arka ucunu kullanın ve yumurtanın uzunluğunun yarısına kadar küçük bir girinti yapın.
Yumurta kabuğu boşluğunun etrafında yaklaşık 10 milimetre aralıklarla 360 derecelik bir halka deseninde küçük girintiler yapın. Tüm girintiler oluşturulduğunda, iki girinti arasındaki kabuğu kırmak için cımbızın sivri ucunu kullanın ve yumurtayı beş dakika boyunca 37 santigrat derece PBS'ye tamamen batırın. Kuluçkanın sonunda, yumurtayı PBS'deki bir tartım teknesinin üzerinde hareket ettirin ve küçük girintiler boyunca çatlaması gereken yumurtayı yavaşça açmak için her iki başparmağınızı da büyük deliğe yerleştirin.
Yumurta kabuğunun etrafında çatlak oluştuğunda, yumurta içeriği kabuktan ayrılana kadar parçaları yavaşça ileri geri hareket ettirirken iki tarafı yavaşça birbirinden ayırın ve içeriği tartım teknesine bırakın. PBS'den yumurta içeriğini içeren tartım teknesini yavaşça kaldırın ve fazla PBS'yi çıkarmak için tekneyi hafifçe eğin. Ardından, tartım teknesini metal bir tartım teknesi tutucusuna yerleştirin.
Bu aşamada embriyoda atan bir kalp görülebilir. Mikroskopi görüntülemesi için bir embriyo ve koryoallantoik membran örneği hazırlamak için, agaroz tabakası yukarı bakacak şekilde yaklaşık 500 mililitre 37 santigrat derece PBS içeren tek litrelik bir Petri kabının dibine agarozlu akustik membranlı bir tutucu yerleştirin. Daha iyi hassasiyet ve hız için tartım teknesini döndürürken vitellus membranını tüm koryoallantoik membranın etrafında altı ila yedi kesim halinde hızlı bir şekilde kesmek için küçük makas kullanın.
Embriyo ve koryoalantoik membranı içeren kesme zarını almak için bir çorba kaşığı kullanın ve embriyoyu ve koryoallantoik membranı içeren kesme zarının hala yumurta sarısı kesesi zarının geri kalanına bağlı olup olmadığının görsel olarak incelenmesini sağlamak için kaşığı yavaşça kaldırın. Dokuyu kurutmadan mümkün olduğunca fazla yumurta sarısından kurtulmak için kaşığı hafifçe eğin ve PBS'deki kesme zarını bir litrelik Petri kabına batırın. Küçük cımbız kullanarak, membranı akustik membranla tutucu üzerinde hareket ettirmeden önce hala bağlı olan yumurta sarısını çıkarmak için membranın bir kenarını tutun ve yavaşça döndürün.
Membranı tutucunun zıt köşelerine sabitlemek ve koryoallantoik membran damarlarını delmekten kaçınmak için bir böcek numunesi pimi kullanın. Her iki köşe de sabitlendiğinde, PBS'nin çoğunu atmak için tutucuyu kaldırın ve hafifçe eğin ve membranın geri kalanının tutucuya düz bir şekilde sabitlenmesini sağlamak için zarı tutucunun üzerine germek ve eşit olarak dağıtmak için küçük cımbızları kullanın. Embriyo sabitlendiğinde, tutucuyu 37 santigrat derecede bir mikroskopi kurulumuna yerleştirin ve damarların optik olarak görselleştirilmesine izin vermek için numune üzerindeki ilgi alanı üzerine akustik ve optik olarak şeffaf bir zar yerleştirin.
Bu temsili analizde, beş, altı, yedi ve sekiz günlük embriyolar ve koryoallantoik membranlar gösterildiği gibi çıkarıldı. Embriyolarda veya koryoalantoik membranlarda kanama veya hasar gözlenemez, bu da bu yöntemlerin embriyoya veya koryoalantoik membran damarlarına zarar vermeden yumurta içeriğini güvenli bir şekilde toplamak için kullanılabileceğini gösterir. Ekstraksiyon sırasında çoklu komplikasyonlar ortaya çıkabilir, bu nedenle protokolü dikkatlice takip etmek ve hasarlı doku örneklerini atmak önemlidir.
Gösterildiği gibi, embriyoya, örneğin mikrokabarcıklar gibi ultrason kontrast maddeleri enjekte edilebilir. Doğumda, mikro kabarcıkların enjekte edilen kan damarının lümeni içinde dolaştığı ve birkaç saat boyunca periferik kan içinde dolaştığı gözlemlenebilir. Mikrokabarcık enjeksiyonundan önce, B modu ile embriyonik kalbin içinde kontrast zaten gözlemlenebilir, ancak yüksek frekanslı ultrason alt harmonik görüntüleme ile gözlenemez.
Mikrokabarcıkların eklenmesi, embriyonun kontrastını ve görünürlüğünü her iki görüntü türünde de arttırır. Embriyo ve koryoallantoik membran içindeki damar ağlarını görselleştirmek için kontrast madde enjeksiyonundan sonra yüksek frekanslı 3D alt harmonik görüntüler de elde edilebilir. Tavuk embriyosu ve koryoallantoik membran damarları, ultrason aracılı ilaç dağıtımını araştırmak için de kullanılabilir.
Bu prosedürü denerken, embriyoyu ve TAT'ı her zaman 37 santigrat derecede tutmak ve kurumasına izin vermemek en önemlisidir. Bu prosedürü takiben, tavuk embriyosu, kontrastlı ultrason görüntüleme veya mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtım çalışmaları yapmak için bir su tankı veya mikroskop gibi farklı kurulumlara yerleştirilebilir. Bu yöntem ve preparat ultrason kontrast madde çalışmaları için uygundur ve kanser ve virüs araştırmaları için de kullanılabilir.
