이 프로토콜은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달 연구를 위해 배양 5일에서 8일 사이에 닭 배아의 준비 및 사용을 설명합니다. 5일에서 8일에 달걀 껍질에서 내용물을 꺼내는 세 가지 방법은 껍질 내에서 발달을 허용하며 기본적인 실험실 도구만 있으면 됩니다. 이 모델은 혈류 영상, 약물 전달, 새로운 초음파 조영제 및 변환기와 같은 초음파 및 혈관 연구의 다양한 측면을 조사하는 데 적합합니다. 생후 5일 된 배아를 준비하려면 5일 배양된 수정란을 인큐베이터 내에서와 같은 방향으로 난자가 있는 예열된 난자 홀더에 넣고 핀셋 팁의 뾰족한 백엔드를 사용하여 난자 맨 위에 작은 움푹 들어간 곳을 만듭니다.
핀셋을 사용하여 계란 길이의 약 2/3 아래로 계란 측면에 두 번째 움푹 들어간 곳을 만들고 한 쌍의 더 큰 핀셋을 사용하여 계란 상단의 움푹 들어간 부분에서 작은 달걀 껍질 조각을 제거하여 공기 주머니가 껍질에 너무 깊이 침투하지 않고 주변 공기와 접촉하도록주의하십시오. 19 게이지 바늘이 장착 된 5 밀리리터 주사기를 사용하여 바늘이 아래쪽을 향하고있는 두 번째 들여 쓰기를 통해 쉘을 관통하고 약 2 밀리리터의 알부민을 배출합니다. 알부민이 수집되면 테이프를 사용하여 구멍을 밀봉하고 알부민을 계량 보트에 분배하십시오.
큰 핀셋을 사용하여 융모막 막 아래의 껍질을 제거하거나 내막을 관통하지 않고 배아와 융모막 막이 완전히 보일 때까지 계란 상단의 작은 구멍을 확대합니다. 충분한 구멍이 생기면 홀더 내에서 계란을 180도 돌려 계란 상단의 구멍이 이제 바닥을 향하도록 합니다. 1-2 분 후에 배아가 떠 올라 바닥에서 보이지 않게됩니다.
전체 배아와 융모막 막이 시야에서 사라지고 노른자 만 보이면 측면 개구부에서 테이프를 제거하십시오. 계란의 내부가 개구부에서 튀어 나와야합니다. 금속 계량 보트 홀더의 계량 보트에 가까운 계란 바닥을 잡고 작은 핀셋의 날카로운 점을 사용하여 개구부의 전체 너비에 걸쳐 멤브레인에 부드럽지만 빠르게 수평 스크래치를 만들고 계란 내용물을 계량 보트에 부드럽게 떨어뜨립니다.
배아가 아직 살아 있는지, 융모막 막 혈관이 손상되지 않았는지, 혈액이나 노른자 누출이 없는지 확인하기 위해 심장 박동이 여전히 존재하는지 확인하십시오. 생존 가능한 배아를 섭씨 37도에 놓고 섭씨 37도 PBS의 30마이크로리터 방울을 배아와 융모막 막에 정기적으로 투여합니다. 6-7 일 된 배아와 융모막 막을 적출하려면 5 일 된 배아에 대해 입증 된대로 난자를 준비하고 19 게이지 바늘이 장착 된 새로운 5 밀리리터 주사기를 사용하여 바늘이 아래쪽을 가리키는 두 번째 움푹 들어간 곳을 통해 껍질을 관통하여 단일 침투로 5-6 밀리리터의 알부민을 배출합니다.
알부민이 수집되면 회수 된 알부민을 대체하기 위해 바늘이 아래쪽을 향하도록 섭씨 37도 PBS의 약 1 밀리리터가 들어있는 10 밀리리터 주사기의 바늘을 껍질 측면에 삽입합니다. 그런 다음 테이프로 틈새를 빠르게 다시 밀봉하고 시연대로 계란 처리를 마칩니다. 8 일 된 수정란에서 배아와 융모막 막을 수확하려면 난자를 수평으로 잡고 한 쌍의 큰 핀셋의 뒤쪽 끝을 사용하고 난자 길이의 절반 정도에 작은 움푹 들어간 곳을 만듭니다.
달걀 껍질 공간을 약 10mm 간격으로 360도 둥글게 패턴으로 작게 들여 쓰기. 모든 움푹 들어간 곳이 만들어지면 핀셋의 뾰족한 끝을 사용하여 두 움푹 들어간 곳 사이의 껍질을 깨고 계란을 섭씨 37도 PBS에 5분 동안 완전히 담그십시오. 배양이 끝나면 PBS의 계량 보트 위로 알을 옮기고 두 엄지 손가락을 큰 구멍에 넣어 작은 움푹 들어간 곳을 따라 갈라지는 알을 부드럽게 엽니다.
달걀 껍질 주위에 균열이 생기면 달걀 내용물이 껍질에서 분리될 때까지 조각을 앞뒤로 부드럽게 움직이면서 양쪽을 부드럽게 잡아당겨 무게를 재는 보트에 떨어뜨립니다. PBS에서 계란 내용물이 들어 있는 계량 보트를 천천히 들어 올리고 웨이 보트를 약간 기울여 과도한 PBS를 제거합니다. 그런 다음 계량 보트를 금속 계량 보트 홀더에 넣습니다.
이 단계에서 배아에서 뛰는 심장을 볼 수 있습니다. 현미경 이미징을 위해 배아 및 융모막 막 샘플을 준비하려면 아가로스 층이 위를 향하도록 섭씨 37도 PBS 약 500밀리리터가 들어 있는 1리터 페트리 접시의 바닥에 아가로스가 있는 음향막이 있는 홀더를 놓습니다. 작은 가위를 사용하여 전체 융모막 막 주위를 6-7 번 절단하여 vitellus 막을 빠르게 절단하고 계량 보트를 회전시켜 정밀도와 속도를 향상시킵니다.
큰 스푼을 사용하여 배아와 융모막 막이 들어있는 컷 아웃 막을 퍼 내고 천천히 숟가락을 들어 올려 배아와 융모막 막이 들어있는 컷 아웃 막이 여전히 난황낭 막의 나머지 부분에 붙어 있는지 육안으로 검사 할 수 있습니다. 숟가락을 약간 기울여 조직을 건조시키지 않고 가능한 한 많은 노른자를 제거하고 잘라낸 막을 1 리터 페트리 접시의 PBS에 담그십시오. 작은 핀셋을 사용하여 멤브레인의 한쪽 가장자리를 잡고 부드럽게 소용돌이 치며 아직 붙어있는 노른자를 제거한 후 음향 멤브레인이있는 홀더 위로 멤브레인을 이동합니다.
곤충 표본 핀을 사용하여 멤브레인을 홀더의 반대쪽 모서리에 고정하고 융모막 막 혈관을 뚫지 마십시오. 양쪽 모서리가 고정되면 홀더를 들어 올리고 약간 기울여 대부분의 PBS를 버리고 작은 핀셋을 사용하여 홀더 위로 멤브레인을 늘리고 고르게 분배하여 나머지 멤브레인이 홀더에 평평하게 고정되도록 합니다. 배아가 고정되면 홀더를 섭씨 37도의 현미경 설정에 놓고 샘플의 관심 영역 위에 음향 및 광학적으로 투명한 막을 놓아 혈관의 광학 시각화를 허용합니다.
이 대표적인 분석에서, 5, 6, 7, 8 일 된 배아와 융모막 막을 제거했다. 배아 또는 융모막 막에 대한 출혈이나 손상은 관찰 될 수 없으며, 이는 이러한 방법을 사용하여 배아 또는 융모 알란토스 막 혈관을 손상시키지 않고 난자 함량을 안전하게 수확 할 수 있음을 나타냅니다. 추출 중에 여러 합병증이 발생할 수 있으므로 프로토콜을주의 깊게 따르고 손상된 조직 샘플을 폐기하는 것이 중요합니다.
입증된 바와 같이, 배아는 예를 들어 마이크로버블과 같은 초음파 조영제를 주입할 수 있다. 전달시, 마이크로버블은 주입된 혈관의 내강 내에서 순환하고 수 시간 동안 말초 혈액 내에서 순환하는 것을 관찰할 수 있다. 마이크로 버블 주입 전에 B 모드로 배아 심장 내부에서 이미 대조를 관찰 할 수 있지만 고주파 초음파 하위 고조파 영상은 관찰 할 수 없습니다.
마이크로 버블을 추가하면 두 가지 유형의 이미지에서 배아의 대비와 가시성이 증가합니다. 고주파 3D 하위 고조파 이미지는 조영제 주입 후 배아 및 융모막 막 내의 혈관 네트워크를 시각화하기 위해 얻을 수도 있습니다. 닭 배아 및 융모막 막 혈관은 또한 초음파 매개 약물 전달을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
이 절차를 시도 할 때 배아와 CAM을 항상 섭씨 37도에서 유지하고 건조시키지 않는 것이 가장 중요합니다. 이 절차에 따라 닭 배아를 물 탱크 또는 현미경과 같은 다양한 설정에 배치하여 조영제 강화 초음파 영상 또는 마이크로버블 매개 약물 전달 연구를 수행할 수 있습니다. 이 방법 및 제제는 초음파 조영제 연구에 적합하며 암 및 바이러스 연구에도 사용할 수 있습니다.
