פרוטוקול זה הוא משמעותי, משום שהוא מספק שיטה להפרדת ארבעה תאים זה מזה, הציטופלסמה, הגרעין, המיטוכונדריה והממברנה. לא רק זה, אלא שמדובר בהליך מדרגי וניתן לשחזור שיש לו תוצאות אמינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפרדת ארבעה תאים עם שימוש מינימלי של חומרי ניקוי, מה שמאפשר הליך פיצול הרבה יותר ניתן לשחזור ואמין.
לבידוד חלבונים ציטוזוליים, לגדל תאי U937 ב-RPMI 1640 עם 10% סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד לסך סופי של 6 על 10 לתאים השמיניים. צנטריפוגה של התרבית, והשהה את כדור התא בטמפרטורת החדר PBS לריכוז סופי של ארבעה על 10 עד התאים השישיים למיליליטר, תוך פיפטציה עדינה כדי לשבור גושים. לאחר צנטריפוגה שנייה, יש לתלות את הכדור במאגר תסיסה קר כקרח A בריכוז סופי של שניים על 10 עד לתאים השביעיים למיליליטר.
הוסיפו 7.5 מיליליטר של תאים לצינור חרוטי על הקרח לצורך מיצוי חלבונים גרעיניים במורד הזרם, והפילו את התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה. יש להשעות את הכדור במאגר בידוד ציטופלסמי בריכוז סופי של שניים על 10 עד לתאים השביעי למיליליטר, תוך פיפטציה עדינה לפירוק גושים, לפני דגירה של התאים למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב קצה על קצה. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את מתלה התא ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה נקי.
צנטריפוגה של הסופר-נאטנט כדי להשקיע את הפסולת התאית. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש, וחזרו על רצף הצנטריפוגות עד שלא ניתן יהיה לצפות בכדור. כאשר הדגימה נקייה מפסולת, אחסנו את הסופר-נטנט המכיל שברים ציטוזוליים למשך עד חודש בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יש להשעות את גלולת התא המאוחסנת במאגר ליזה A לריכוז סופי של ארבעה על 10 עד לתאים השישיים למיליליטר. עבור הומוגניזציה של תאים, צנטריפוגה של תרחיף התא ולהשליך את supernatant כדי להסיר עודף digitonin ומזהמים סיסטוליים. יש להשעות את הכדור בחיץ הומוגניזציה של תאים קרים כקרח בריכוז סופי של 4 על 10 עד לתאים השישיים למיליליטר למשך דגירה של 30 דקות על קרח.
בינתיים, עבור תזה מכנית מבוססת חרוזים, הוסף 30 גרם של חרוזי נירוסטה שטופים מראש 3.2 מילימטר ל -15 מיליליטר של חיץ ליזה B בצינור חצאית של 50 מיליליטר על קרח כדי להתקרר. בסוף הדגירה, החלף את החיץ בצינור החצאית עם השעיית התא ומזג את התאים במשך חמש דקות במהירות שמונה. לאחר תזה, להעביר את homogenate לצינור נקי.
צנטריפוגה הומוגנית, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש. כדי להסיר את כל הפסולת שנותרה מהמדגם, צנטריפוגה את ההומוגנט שלוש פעמים כפי שצוין, ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חדש לאחר כל צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, כדי לבודד את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי, העבירו את הסופר-נטנט לצינור חדש לצנטריפוגה.
לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש והניחו את הכדור הגולמי המכיל שבר מיטוכונדריאלי על קרח. כדי לבודד את שבר הממברנה, צנטריפוגה של הסופרנטנט שנאסף, ולאחר השלכת הסופרנטנט מניחים את הכדור המכיל שבר קרום גולמי על קרח. לטיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית, יש להשעות את כדורי המיטוכונדריה והממברנה הגולמיים ב-200 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס B, ו-1.8 מיליליטר של יודיקסנול.
כדי ליצור שיפוע יודיקסנול רציף עבור כל דגימה, ראשית, הוסף מיליליטר אחד של 15% יודיקסנול לתחתיתו של צינור אולטרה-צנטריפוגה אחד בעל שמונה מיליליטר פתוח בעל דופן דקה לכל דגימה. לאחר מכן, שכבה ברצף מיליליטר אחד של 20% יודיקסנול, מיליליטר אחד של 25% יודיקסנול, מיליליטר אחד של 30% יודיקסנול, ומיליליטר אחד של 35% יודיקסנול מתחת לשכבת 15%יודיקסנול בכל צינור. הוסף שני מיליליטר של תרחיף גלולה מיטוכונדריאלי גולמי מתחת לשכבה התחתונה של שיפוע אחד, ושני מיליליטר של תרחיף גלולה קרום גולמי מתחת לשכבה התחתונה של השיפוע השני.
שכבה בזהירות מיליליטר אחד של 10% יודיקסנול על החלק העליון של כל שיפוע ולאזן את הצינורות בתוך 10 מיקרוגרם אחד של השני על ידי תוספת של 10% יודיקסנול לפי הצורך לפני טיהור שברים המיטוכונדריאליים והממברנה על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. בסוף ההפרדה, השתמש במחט כדי לנקב את הצד של הצינורות הדקים כדי לאסוף את הרצועות הנראות מכל דגימה. לבידוד חלבונים גרעיניים, צנטריפוגה של 7.5 מיליליטר אליקוט של תאים התלויים בחיץ תזה A, והשהה את הכדור ב-800 מיקרוליטרים של חיץ סילוק תאים קרים כקרח עם פיפטינג ומערבולות.
דגירה של התרחיף על הקרח במשך 30 דקות כדי לשבש את קרומי הפלזמה והאברונים, תוך הגנה על החלבונים הגרעיניים. בתום הדגירה, צנטריפוגה של תליית התא והשעיית הכדור על ידי צנרת עדינה ב-800 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס גרעיני קר כקרח בתוספת יחידה אחת למיקרוליטר של בנזונאז. לדגום את התערובת על קצה מעל הקצה מסובב בארבע מעלות צלזיוס כדי לשבש את קרום הגרעין.
לאחר 30 דקות, סוניקו את התערובת שלוש פעמים למשך חמש שניות בעוצמה של 20% עם הפסקה של חמש שניות בין פולסים כדי להטות את חומצות הגרעין. לאחר הסוניקציה האחרונה, צנטריפוגה את ההומוגנט ולאסוף את supernatant כמו חלק גרעיני מבלי להפריע את הכדור. כתם מערבי של כל אחד מהשברים לאחר טיהור גרדיאנט צפיפות מראה לוקליזציה של החלק המיטוכונדריאלי לשכבות 25 ו-30% יודיקסנול, ולוקליזציה של שבר הממברנה לשכבות 10% ו-15% יודיקסנול.
ניתוח דם מערבי גם מאשר כי כל דגימה מבודדת היא טהורה ונקייה מזיהום על ידי חלבונים מחלקים אחרים של התא. בנוסף, ניתוח דנסיטומטרי של עוצמת הפסים של כל דגימה מאשר את השכפול והמובהקות הסטטיסטית של הנתונים. ביצוע לא תקין של הפיצול עלול לגרום לזיהום צולב של הרכיבים התאיים.
ריכוז גבוה של היסטון H3 בחלק הציטוזולי, למשל, יכול לנבוע מהבהרה לא נכונה של השבר הציטוזולי. כישלון במהלך טיהור הצפיפות האיזופיקנית עלול לגרום לזיהום של חלק הממברנה. זה יכול להיות שימושי לבצע בדיקת כימות חלבון לפני ניתוח הדם המערבי כדי לאשר כי השברים אכן מכילים חלבון כדי לאפשר העמסת ג'ל על בסיס כמות החלבון, ולאשר כי ההליך בוצע כראוי.
זה קריטי כי השבר הציטופלסמי לא יכיל גלולה. כתמים מערביים, או ELISAs עשויים להתבצע לאחר הליך זה כדי לאפשר לך לנתח את המיקום התת-תאי של חלבונים שונים בתנאים מסוימים. טכניקה זו אפשרה לנו לנתח את הסחר בגורמי מוות תאיים שונים בתנאים של היפרגליקמיה.
וכך, עבורנו, זה עזר לשפוך אור על המנגנון של המעבר ההיפרגליקמי מאפופטוזיס לנמק.
