العدلات هي خلايا متمايزة بشكل نهائي ، وحاليا لا توجد خطوط خلايا لتلخيص بيولوجيا العدلات بالكامل. وبالتالي فمن الضروري الحصول على العدلات نقية، معطلة، صحية، والطازجة لدراسة البيولوجيا الخاصة بهم. تجمع طريقة التحديث هذه بين تدرج الكثافة والترسب والتحلل اللطيف للحصول على إعداد العدلات النقي.
من السهل إعدادها ، وتتطلب معدات بسيطة وممارسة قليلة. الجانب التقني، مثل طبقات التدرج، من هذه الطريقة سوف تتطلب بعض الممارسة لإتقان، ولكن بمجرد أن يتم اتقان التدرج الخطوات الأخرى ينبغي أن تأتي نسيم. تبدأ بتعقيم معطف برتقالي، والتعبئة والتغليف، وغطاء محرك السيارة صفح.
ثم أضف 10 ملليلتر من الدم إلى أنبوب 50 ملليلتر. لتمييع الدم لمنظف التدرج، أضف 5٪ FBS/HBSS وماكياج حجم يصل إلى 35 ملليلتر. بعد إغلاق الغطاء، عكس الأنبوب عدة مرات لخلط ومن ثم الحفاظ على أنبوب رأسا على عقب للحصول على الجزء السفلي خالية من خلايا الدم الحمراء.
أضف 10 ملليلترات من متوسط تدرج الكثافة مباشرة تحت الدم ، مما يضمن عدم خلط الوسط والدم وتظل الواجهة حادة. قم بتدليك الأنبوب 400 مرة جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من تعطيل الفرامل. بعد الغزل، لاحظ التدرج فصل إلى طبقة بلازما مصل أعلى، حلقة بيضاء متوسطة من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية، وطبقة متوسطة التدرج كثافة غائمة، والكريهة السفلي تتكون من شريط العدلات رقيقة بيضاء على رأس خلايا الدم الحمراء.
لإزالة PBMC، والخروج ماصة الشفط مباشرة في طبقة PBMC و يستنشق تماما في حين يتم الحصول على انخفاض طبقة البلازما المصل كما تتم إزالة الحلقة. كشط جانب الأنبوب مع ماصة الشفط لتحقيق أقصى قدر من إزالة PBMC. إزالة بعناية كثافة غائمة طبقة متوسطة الانحدار بين حلقة PBMC والكريهات العدلات / RBC.
لترسيب الكريات الحمراء، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل بيليه العدلات/ RBC إلى أنبوب نظيف. ثم أضف 5٪ FBS/HBSS إلى وحدة تخزين نهائية من 25 ملليلتر. إضافة مباشرة 25 ملليلتر من محلول ما قبل الحرب التي تحتوي على 3٪ dextran/0.9٪ NaCl في الماء في الأنبوب وتخلط بلطف عن طريق الانعكاس.
ضع الأنبوب على سطح مستو وغير مهتز لمدة 15 دقيقة. بعد وضع الأنبوب مرة أخرى في غطاء محرك السيارة، تزج قليلا ماصة في السائل وجمع ما يقرب من 30 ملليلتر من الطبقة العليا بعد السطح السائل إلى أسفل. تدور أنبوب للحصول على بيليه الأحمر دون الجسيمات العائمة في وسائل الإعلام.
لتحلل RBC المتبقية، يستنشق بلطف supernatant دون تعطيل بيليه. أضف 25 ملليمترا من الماء فائق النحافة العقيم مباشرة إلى الأنبوب واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب لمدة 28 ثانية لتسلي RBC. ثم، إضافة فورا 25 ملليلتر من محلول معقم 1.8٪ NaCl المعدة في الماء في الأنبوب وجلب الحل مرة أخرى إلى الظروف متساوي التوتر عن طريق خلط لطيف.
تدور الأنبوب في 200 مرة ز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق مع انخفاض الفرامل للحد من ترسب RBC والصفائح الدموية مع العدلات. لإعادة تعليق بيليه العدلات البيضاء، إضافة مباشرة المتوسطة الثقافة على بيليه ولكن لا ماصة صعودا وهبوطا. بعد ذلك، هز الأنبوب أفقيا من جانب إلى آخر لتقليل تنشيط الخلية.
إذا لوحظ تجميع الخلايا أو تكتل، تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة 70 ميكرومتر لتجاهل العدلات متجمعة. لتقييم جودة إعداد العدلات المعزول، قم بتلطيخ الخلايا بعلامات محددة للنيوتروفيل واليوزينية وعلامة التنشيط. بعد الحصول على 20,000 خلية عن طريق قياس التدفق الخلوي، قم بتحليل نقاء الخلية وتنشيطها باستخدام استراتيجيات الغاينج وحدد صلاحية الخلية باستخدام الملحق الخامس/البروبيديوم يوديد كما هو موضح في مخطوطة النص.
أدى تدرج الكثافة مع سرعة منخفضة العدلات مع المزيد من النقاء ، في حين أن السرعة العالية أدت إلى زيادة الغلة على حساب النقاء. وباستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور، قدم توزيع الخلية وحده تقديرا لجودة عزلة الخلية، ولكن ينبغي تفضيل استخدام علامات خلايا محددة. وكانت مجموعات الخلايا الملوثة التي تم تحديدها هي الخلايا الأحادية والخلايا الليمفاوية واليوزينيات.
تم تحقيق غلة العدلات الهائلة باستخدام هذا البروتوكول. تم تقييم التعبير عن CD62L. انخفض متوسط كثافة الفلورسنت لCD62L في خلايا التحكم الإيجابية ، مما يشير إلى سفك CD62L وتنشيط العدلات.
يجب تقييم صحة العدلات قبل إجراء الفحص حيث أن العدلات لها نصف عمر قصير نسبيا والتنشيط يقصر الحياة. بعد تنقية العدلات باستخدام تدرج الكثافة والميكروبات التجارية ، تم استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة وتم تحليل بقاء الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. ويشير القياس الكمي للخلايا القابلة للحياة إلى أن تنقية تدرج الكثافة تؤدي إلى خلايا أكثر قابلية للحياة بعد 24 ساعة من التنقية باستخدام عدة.
من المهم أن يتم تنفيذ خطوات طبقات التدرج والطرد المركزي قدر الإمكان لأنها ستؤثر بشكل كبير على جودة التحضير. يمكن إجراء التجارب المختبرية والمقاييس الكيميائية الحيوية بعد هذا الإجراء. أيضا، يمكن إجراء الاختيار السلبي إذا كانت هناك حاجة إلى خلايا فائقة النبور كما هو الحال في تجارب السيتوكين والتعبير عن البروتين.
