Este protocolo es significativo, porque proporciona un método para separar cuatro compartimentos celulares entre sí, el citoplasma, el núcleo, las mitocondrias y la membrana. No solo eso, sino que es un procedimiento escalable y reproducible que tiene resultados confiables. La principal ventaja de esta técnica es la separación de cuatro compartimentos celulares con un uso mínimo de detergentes, lo que permite un procedimiento de fraccionamiento mucho más reproducible y confiable.
Para el aislamiento de proteínas citosólicas, cultive células U937 en RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta un total final de seis por 10 a octava células. Centrifugar el cultivo y resuspender el pellet celular a temperatura ambiente PBS a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta células por mililitro, pipeteando suavemente para romper los grumos. Después de una segunda centrifugación, resuspender el pellet en tampón de lisis A helado a una concentración final de dos por 10 a la séptima celda por mililitro.
Agregue 7,5 mililitros de células a un tubo cónico sobre hielo para la extracción de proteínas nucleares aguas abajo, y granule las células restantes por centrifugación. Resuspender el pellet en tampón de aislamiento citoplasmático a una concentración final de dos por 10 a la séptima célula por mililitro, pipeteando suavemente para romper los grumos, antes de incubar las células durante 20 minutos a cuatro grados centígrados con rotación de extremo a extremo. Al final de la incubación, centrifugar la suspensión celular y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
Centrifugar el sobrenadante para sedimentar los restos celulares. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y repita la secuencia de centrifugación hasta que no se pueda observar ningún pellet. Cuando la muestra esté libre de residuos, almacene el sobrenadante que contiene fracción citosólica durante un máximo de un mes a cuatro grados centígrados.
Luego resuspenda el pellet de celda almacenado en el tampón de lisis A a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta celda por mililitro. Para la homogeneización celular, centrifugar la suspensión celular y desechar el sobrenadante para eliminar el exceso de digitonina y contaminantes sistólicos. Resuspender el pellet en tampón de homogeneización de celdas heladas a una concentración final de cuatro por 10 a la sexta celda por mililitro para una incubación de 30 minutos en hielo.
Mientras tanto, para la lisis mecánica basada en cuentas, agregue 30 gramos de perlas prelavadas de acero inoxidable de 3.2 milímetros a 15 mililitros de tampón de lisis B en un tubo con faldón de 50 mililitros sobre hielo para enfriar. Al final de la incubación, reemplace el tampón en el tubo con faldón con suspensión celular y mezcle las celdas durante cinco minutos a velocidad ocho. Después de la lisis, transfiera el homogeneizado a un tubo limpio.
Centrifugar el homogeneizado, luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Para eliminar cualquier residuo restante de la muestra, centrifugar el homogeneizado tres veces como se indica, transfiriendo el sobrenadante a un nuevo tubo después de cada centrifugación. Después de la última centrifugación, para aislar la fracción mitocondrial cruda, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo para la centrifugación.
Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y coloque el pellet crudo que contiene fracción mitocondrial en hielo. Para aislar la fracción de membrana, centrifugar el sobrenadante recolectado y, después de desecharlo, coloque el pellet crudo que contiene la fracción de membrana en hielo. Para la purificación del gradiente de densidad isopícnica, resuspenda los gránulos de fracción mitocondrial y de membrana crudos en 200 microlitros de tampón B de lisis y 1.8 mililitros de iodixanol.
Para crear un gradiente de iodixanol discontinuo para cada muestra, primero, agregue un mililitro de 15% de iodixanol al fondo de un tubo de ultracentrífuga de pared delgada y tapa abierta de ocho mililitros por muestra. A continuación, subyace secuencialmente un mililitro de 20% de iodixanol, un mililitro de 25% de iodixanol, un mililitro de 30% de iodixanol y un mililitro de 35% de iodixanol por debajo de la capa de 15% de iodixanol en cada tubo. Agregue dos mililitros de la suspensión de pellets mitocondriales crudos debajo de la capa inferior de un gradiente, y dos mililitros de la suspensión de pellets de membrana cruda debajo de la capa inferior del segundo gradiente.
Coloque cuidadosamente un mililitro de 10% de iodixanol en la parte superior de cada gradiente y equilibre los tubos dentro de 10 microgramos entre sí mediante la adición de 10% de iodixanol según sea necesario antes de purificar las fracciones mitocondriales y de membrana por centrifugación de gradiente de densidad. Al final de la separación, use una aguja para perforar el lado de los tubos de paredes delgadas para recoger las bandas visibles de cada muestra. Para el aislamiento de proteínas nucleares, centrifugar la alícuota de 7,5 mililitros de células suspendidas en el tampón de lisis A y resuspender el pellet en 800 microlitros de tampón de solubilización de células heladas con pipeteo y vórtice.
Incubar la suspensión en hielo durante 30 minutos para interrumpir las membranas plasmáticas y de orgánulos, mientras protege las proteínas nucleares. Al final de la incubación, centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet pipeteando suavemente en 800 microlitros de tampón de lisis nuclear helado complementado con una unidad por microlitro de Benzonasa. Incubar la mezcla en un rotador de extremo a extremo a cuatro grados centígrados para interrumpir la membrana nuclear.
Después de 30 minutos, sonicar la mezcla tres veces durante cinco segundos al 20% de potencia con una pausa de cinco segundos entre pulsos para cortar los ácidos nucleicos. Después de la última sonicación, centrifugar el homogeneizado y recoger el sobrenadante como la fracción nuclear sin perturbar el pellet. Western blot de cada una de las fracciones después de la purificación del gradiente de densidad muestra la localización de la fracción mitocondrial a las capas de 25 y 30% de iodixanol, y la localización de la fracción de membrana a las capas de 10 y 15% de iodixanol.
El análisis de sangre occidental también confirma que cada muestra aislada es pura y libre de contaminación por proteínas de otras partes de la célula. Además, el análisis densitométrico de la intensidad de banda de cada muestra confirma la reproducibilidad y significación estadística de los datos. La ejecución incorrecta del fraccionamiento puede resultar en la contaminación cruzada de los componentes celulares.
Una alta concentración de histona H3 en la fracción citosólica, por ejemplo, puede deberse a una clarificación inadecuada de la fracción citosólica. La falla durante la purificación de la densidad isopícnica puede resultar en la contaminación de la fracción de membrana. Puede ser útil realizar un ensayo de cuantificación de proteínas antes del análisis de sangre occidental para confirmar que las fracciones contienen proteínas para permitir la carga de gel en función de la cantidad de proteína y para confirmar que el procedimiento se ha ejecutado correctamente.
Es crítico que la fracción citoplasmática no contenga un pellet. Las manchas occidentales o ELISA se pueden realizar después de este procedimiento para permitirle analizar la ubicación subcelular de diferentes proteínas bajo ciertas condiciones. Esta técnica nos permitió analizar el tráfico de diferentes factores de muerte celular en condiciones de hiperglucemia.
Y así, para nosotros, esto ayudó a arrojar luz sobre el mecanismo del cambio hiperglucémico de la apoptosis a la necrosis.
