Этот протокол важен, потому что он обеспечивает метод отделения четырех клеточных компартментов друг от друга: цитоплазмы, ядра, митохондрий и мембраны. Не только это, но это масштабируемая, воспроизводимая процедура, которая имеет надежные результаты. Основным преимуществом этой методики является разделение четырех клеточных компартментов с минимальным использованием моющих средств, что позволяет проводить гораздо более воспроизводимую, надежную процедуру фракционирования.
Для выделения цитозольного белка вырастите клетки U937 в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 градусах Цельсия и 5% углекислым газом до конечного общего числа шесть на 10 к восьмым клеткам. Центрифугируют культуру и повторно суспендируют ячейку гранулы при комнатной температуре PBS до конечной концентрации от четырех на 10 до шестой клетки на миллилитр, мягко пипетируя, чтобы разбить сгустки. После второй центрифугирования повторно суспендируют гранулу в буфере ледяного холодного лизиса А в конечной концентрации от двух на 10 до седьмых клеток на миллилитр.
Добавьте 7,5 миллилитров клеток в коническую трубку на льду для последующей экстракции ядерного белка и гранулируйте оставшиеся клетки центрифугированием. Повторно суспендируют гранулу в буфере цитоплазматической изоляции в конечной концентрации от двух на 10 до седьмых клеток на миллилитр, осторожно пипетируя, чтобы разбить сгустки, прежде чем инкубировать клетки в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия с конечным вращением. В конце инкубации центрифугируют клеточную суспензию и переносят супернатант в чистую центрифужную трубку.
Центрифугировать супернатант для осаждения клеточного мусора. После центрифугирования перенесите супернатант в новую центрифужную трубку и повторяйте последовательность центрифугирования до тех пор, пока не будет наблюдаться гранула. Когда образец будет очищен от мусора, храните цитозольную фракцию, содержащий супернатант, до одного месяца при четырех градусах Цельсия.
Затем повторно суспендируют хранящуюся клеточную гранулу в буфере лизиса А до конечной концентрации четыре на 10 до шестой клетки на миллилитр. Для гомогенизации клеток центрифугируют клеточную суспензию и выбрасывают надосадочную часть для удаления избытка дигитонина и систолических загрязнений. Повторно суспендируют гранулу в буфере гомогенизации ледяных клеток в конечной концентрации от четырех на 10 до шестой клетки на миллилитр для 30-минутной инкубации на льду.
Между тем, для механического лизиса на основе бисера добавьте 30 граммов предварительно промытых шариков из нержавеющей стали 3,2 миллиметра к 15 миллилитрам лизисного буфера B в 50-миллилитровой окантовке на льду для охлаждения. В конце инкубации замените буфер в плинтусной трубке клеточной суспензией и смешивайте клетки в течение пяти минут со скоростью восемь. После лизиса перенесите гомогенат в чистую трубку.
Центрифугируйте гомогенат, затем перенесите супернатант в новую трубку. Чтобы удалить оставшийся мусор из образца, центрифугируют гомогенат три раза, как указано, перенося супернатант в новую трубку после каждой центрифугирования. После последнего центрифугирования, чтобы выделить сырую митохондриальную фракцию, перенесите супернатант в новую трубку для центрифугирования.
После центрифугирования перенесите супернатант в новую трубку и поместите на лед сырую гранулу, содержащую митохондриальную фракцию. Чтобы изолировать мембранную фракцию, центрифугируют собранный супернатант, а после выброса супернатанта помещают на лед сырую мембранную фракционную фракционную гранулу. Для очистки градиента изопикновой плотности повторно суспендируют сырые гранулы митохондриальной и мембранной фракций в 200 микролитрах лизисного буфера В и 1,8 миллилитра йодиксанола.
Чтобы создать прерывистый градиент йодиксанола для каждого образца, сначала добавьте один миллилитр 15% йодиксанола к нижней части одной восьмимиллилитрной тонкостенной ультрацентрифужной трубки на образец. Затем последовательно подложите один миллилитр 20% йодиксанола, один миллилитр 25% йодиксанола, один миллилитр 30% йодиксанола и один миллилитр 35% йодиксанола ниже слоя 15% йодиксанола в каждой трубке. Добавьте два миллилитра сырой митохондриальной суспензии гранул под нижний слой одного градиента и два миллилитра грубой мембранной суспензии гранул под нижний слой второго градиента.
Осторожно нанесите один миллилитр 10% йодиксанола на верхнюю часть каждого градиента и сбалансируйте пробирки в пределах 10 микрограммов друг от друга путем добавления 10% йодиксанола по мере необходимости перед очисткой митохондриальной и мембранной фракций центрифугированием градиента плотности. В конце разделения используйте иглу, чтобы проколоть сторону тонкостенных трубок, чтобы собрать видимые полосы с каждого образца. Для выделения ядерного белка центрифугируют 7,5-миллилитровую аликвоту клеток, взвешенных в буфере лизиса А, и повторно суспендируют гранулу в 800 микролитрах буфера солюбилизации ледяных холодных клеток с пипеткой и вихрем.
Инкубируйте суспензию на льду в течение 30 минут, чтобы разрушить мембраны плазмы и органелл, защищая при этом ядерные белки. В конце инкубации центрифугируют клеточную суспензию и повторно суспендируют гранулу путем осторожного пипетирования в 800 микролитров ледяного буфера ядерного лизиса, дополненного одной единицей на микролитр бензоназы. Инкубируйте смесь на торцевом ротаторе при четырех градусах Цельсия, чтобы разрушить ядерную мембрану.
Через 30 минут обжайте смесь ультразвуком три раза в течение пяти секунд с мощностью 20% с пятисекундной паузой между импульсами, чтобы срезать нуклеиновые кислоты. После последней обработки ультразвуком центрифугируют гомогенат и собирают супернатант в виде ядерной фракции, не нарушая гранулу. Вестерн-блоттинг каждой из фракций после очистки градиента плотности показывает локализацию митохондриальной фракции на 25 и 30% йодиксаноловых слоях, а локализацию мембранной фракции на 10 и 15% йодиксаноловых слоев.
Западный анализ крови также подтверждает, что каждый изолированный образец является чистым и свободным от загрязнения белками из других частей клетки. Кроме того, денситометрический анализ интенсивности полосы каждой выборки подтверждает воспроизводимость и статистическую значимость данных. Неправильное выполнение фракционирования может привести к перекрестному загрязнению клеточных компонентов.
Высокая концентрация гистона Н3 в цитозольной фракции, например, может быть обусловлена неправильным осветлением цитозольной фракции. Отказ при очистке изопикновой плотности может привести к загрязнению мембранной фракции. Может быть полезно выполнить количественный анализ белка перед западным анализом крови, чтобы подтвердить, что фракции действительно содержат белок, чтобы обеспечить загрузку геля на основе количества белка, и подтвердить, что процедура была выполнена должным образом.
Очень важно, чтобы цитоплазматическая фракция не содержала гранул. Вестерн-блоттинги или ИФА могут быть выполнены после этой процедуры, чтобы позволить вам проанализировать субклеточное расположение различных белков при определенных условиях. Данная методика позволила проанализировать торговлю различными факторами гибели клеток в условиях гипергликемии.
И вот, для нас это помогло пролить свет на механизм гипергликемического перехода от апоптоза к некрозу.
