التحليل المنهجي لتسجيل النقاط هو تقنية لتقييم الإصابات المخاطية ، وتسهيل التفسير النسيجي الذي يمكن أن يؤديه باحثون مدربون. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها مجانية وسهلة الاستخدام. يسمح بإجراء تحليل كمي للبيانات النسيجية التي تم الحصول عليها من أمعاء الفئران المصابة بالتهاب القولون.
يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ لتفسير شدة المرض في القولون بأكمله ، وهو أمر ضروري لمقارنة المرض من الحيوانات من خلفيات وراثية مختلفة. لإعداد الأنسجة، من المهم تنظيم جميع الكواشف والمواد. ابدأ بوضع فأرة القتل الرحيم على لوحة تشريح في وضع ية وشل أطراف الماوس باستخدام إبر قياس 20 1.5 بوصة.
باستخدام ملقط ومقص، وجعل شق صغير على جلد البطن وسحبه إلى الجانب لفضح الصفاق، ثم فتح تجويف البطن مع شق خط الوسط في الصفاق من عظم العانة إلى جانبي البطن. إزالة الأنسجة والأعضاء بعناية حتى يتم تصور الأمعاء الغليظة. قطع عظم الحوض على جانبي القولون لتصور كامل للجهاز، وتمتد من فتحة شج نحو cecum.
إزالة الدهون بلطف، الأوردة الصغيرة، والشرايين المرتبطة القولون في حين تشريح بعناية الجهاز، وقطع قريبة فقط إلى فتحة المشج وdistal إلى cecum. مسح بعناية القولون مع برنامج تلفزيوني لإزالة محتويات البراز باستخدام إبرة الغافاج البلاستيك مرنة إدراجها من خلال فتحة الشرج. وضع القولون في خط مستقيم وفتح طوليا على طول الشريان المتوسطي.
تقسيم القولون طوليا من القاصي إلى نهاية قريبة. استخدام نصف الأنسجة للتحليل النسيجي والنصف الآخر للطخة الغربية، PCR، أو تدحرجت في لفة السويسرية الثانية للفحص المجهري المناعي المجمدة الطازجة. تقليم الأنسجة الزائدة من القولون القريب مع شفرة حلاقة حتى يتم الحصول على نفس العرض تقريبا على طول القولون كله.
محاذاة القولون لفضح التجويف وتسطيح الأنسجة تماما باستخدام إبرة الغافاج مرنة. إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر للحفاظ على رطوبة الأنسجة طوال العملية. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة باستخدام مسح الورق.
مع حقنة وإبرة gavage، إضافة 10٪ محايدة العازلة حل الفورمالين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لإصلاح وتسطيح الأنسجة، ثم استخدام ملقط مستقيم للاستيلاء على نهاية القولون البعيدة وتحريف القولون في دوائر متحدة المركز من البعيدة إلى نهاية قريبة. أدخل إبرة قياس 27 لتثبيت القولون في الوسط وعقد شكل لفة السويسرية، ثم وضع لفة السويسرية في كاسيت تضمين داخل حاوية عينة النسيجية توجيه الأنسجة بالتوازي مع ما يتعلق كاسيت. إصلاح الأنسجة في 10٪ محايدة العازلة حل الفورماليين بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
بعد التثبيت بين عشية وضحاها، وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 70٪ الإيثانول قبل عملية تضمين البارافين وإزالة الإبرة من لفة السويسرية قبل المتابعة. يمكن تخزين الأنسجة في الإيثانول في درجة حرارة الغرفة حتى تضمين البارافين.
بعد فتح الصور الممسوحة ضوئيا في برنامج معالجة الصور، تحقق من أن القولون بأكمله مرئي وأنه لا توجد مناطق مفقودة من العينة. قم بتنشيط أدوات تصوير التسمية وشريط المقياس لتحديد الشرائح الممسوحة ضوئيا بشكل صحيح بالنقر على صور التسمية. افتح أداة التعليقات التوضيحية بالنقر فوق التعليقات التوضيحية وإنشاء ثلاث طبقات مختلفة بالنقر فوق طبقة جديدة لتحديد الطول الإجمالي للفة السويسرية أو الالتهاب أو الإصابة والتآكل أو التقرح.
اختر لونا مختلفا لكل طبقة بالنقر فوق لون الطبقة. قياس طول كل طبقة أو فئة عن طريق النقر على أداة القلم لرسم خط بعد الغشاء المخاطي العضلات، وتحريك المؤشر حسب الحاجة لتصور المنطقة المجاورة للتحليل. عرض الصورة في 400 ميكرومتر التكبير لتسهيل التصور الكافي للغشاء المخاطي العضلات.
في كل مرة يتم فيها إيقاف القلم، سيتم إنشاء منطقة طبقة جديدة صغيرة. يمكن تصورها وتحريرها مع علامة التبويب مناطق الطبقة. راجع الطول الإجمالي، والالتهاب أو الإصابة، والتآكل أو التقرح الذي يقاس باستخدام الغشاء المخاطي العضلي كمرجع.
بمجرد تعريف كافة الطبقات، قم بتصدير البيانات باستخدام شبكة التصدير إلى زر ملف نصي داخل خيارات مناطق الطبقة. افتح الملفات النصية وانسخ البيانات إلى برنامج جدول بيانات. مجموع جميع شرائح من كل منطقة وحساب النسبة المئوية للإصابة والتقرح فيما يتعلق بالطول الكلي.
النظر في ثلاث خصائص رئيسية لحساب درجة التهاب القولون النسيجي وتقييم شدة المرض. تحقق من وجود الغشاء المخاطي المعوي الصحي ، والذي يتميز بالخلايا الظهارية المنظمة في المحور الإنارة السرداب ، والبروبريا الصفيحة مع عدد قليل من الخلايا المناعية والغشاء المخاطي العضلي تحت الجلد. بعد ذلك ، تحقق من وجود التهاب أو إصابة ، والتي تتميز با سرداب ظهارية مخففة أو مفقودة جزئيا من الخلايا الظهارية والتهاب المخاطية مع تسلل العدلات إلى السراديب.
وأخيرا، تحقق من وجود تآكل أو تقرح، والذي يتميز بمناطق خالية من الظهارة السطحية أو المناطق التي تفتقر تماما إلى سرداب الظهارة مع أو بدون الكريات البيض المرتبطة بها. لتوضيح موثوقية هذا التحليل النتيجة التهاب القولون النسيجي في سياق الضرر المخاطي، 2.5٪ DSS تدار في مياه الشرب من ثمانية فئران C57BL6 البرية من نوع لمدة خمسة أيام، تليها فترة الانتعاش مع المياه العادية لمدة خمسة أيام. بقي وزن الجسم ثابتا أثناء الإدارة الحادة ل DSS ، ولكنه انخفض بشكل كبير عندما بدأت الفئران في شرب مياه الصنبور العادية.
ظهر الدم والبراز الناعم بعد ثلاثة أيام من إدارة DSS واستمر حتى اليوم الثامن من التجربة. وتشير هذه الملاحظات إلى أن الآثار الأكثر ضررا للتعرض ل DSS لوحظت خلال فترة النقاهة بين اليومين الخامس والثامن. أكد قياس طول القولون في اليوم العاشر تقصيرا كبيرا في نهاية التجربة.
تم حصاد الكولون في اليوم صفر، اثنين، خمسة، سبعة، ثمانية، و 10 لجعل لفات البارافين السويسرية. كانت الأنسجة ملطخة بفيروس H&,E وتم تحليل فحوصات عالية الوضوح لحساب درجة التهاب القولون النسيجي والنسبة المئوية للإصابة والتقرح. لوحظت هندسة سرداب طبيعية في الفئران غير المعالجة.
بعد يومين من إدارة DSS ، لوحظ تجنيد الخلايا المناعية. في اليوم الخامس، تظهر الخلايا الظهارية معطوبة وكان هناك تسلل من العدلات عبر الظهارة المرتبطة بالإصابة الظهارية. من اليوم الخامس إلى الثامن ، لوحظت مناطق فقدان الظهارية مع الالتهاب والتقرح.
في اليوم العاشر، بدأت الخلايا الظهارية في تجديد وإعادة إسكان المناطق المتقرحة، واستعادة الغشاء المخاطي القولوني ببطء. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم إنشاء لفة سويسرية موجهة بشكل صحيح ومصانة بشكل جيد، وكذلك تحديد الالتهاب المخاطي بشكل صحيح أو الإصابة والتقرح أو التآكل. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الإصابة كميا على طول الغشاء المخاطي القولوني في نماذج أخرى من التهاب القولون ، مثل TMS أو نموذج نقل الخلايا التائية.
