Систематический анализ скоринга является методом оценки слизистой травмы, облегчая гистологическую интерпретацию, которая может быть выполнена обученными исследователями. Основными преимуществами этого метода является то, что он является бесплатным и простым в использовании. Это позволяет провести количественный анализ гистологических данных, полученных из кишечника мышей с колитом.
Этот протокол обеспечивает быстрый и воспроизводимый способ интерпретации тяжести заболевания всей толстой кишки, который необходим для сравнения болезни у животных различного генетического происхождения. Для приготовления тканей важно организовать все реагенты и материалы. Начните с размещения усыпленной мыши на вскрытии площадку в положении на спине и обездвижить конечности мыши с помощью 20 калибровочных 1,5 дюймовых игл.
Используя типсы и ножницы, сделать небольшой разрез на брюшной коже и вытащить его в сторону, чтобы разоблачить брюшной полости, а затем открыть брюшную полость с средней линии разреза в брюшной полости от лобковой кости по бокам живота. Тщательно удалите ткани и органы до тех пор, пока не будет визуализирована большая кишка. Вырезать тазовой кости по обе стороны толстой кишки, чтобы полностью визуализировать орган, простирающийся от ануса к cecum.
Аккуратно удалить жир, мелкие вены и артерии, прикрепленные к толстой кишке, тщательно рассекая орган, резки только проксимальные к анусу и дистал cecum. Тщательно промыть толстой кишки с PBS для удаления фекального содержимого с помощью гибкой пластиковой иглы гаваж вставлены через анус. Распоистите толстую кишку по прямой и откройте продольно вдоль мезентерической артерии.
Раздвоить толстой кишки продольно от дистала до проксимального конца. Используйте половину ткани для гистологического анализа, а другую половину для западной помарки, ПЦР, или свернутой во второй швейцарский рулон для свежей замороженной микроскопии иммунофлюоресценции. Обрезать дополнительные ткани из проксимальной толстой кишки с лезвием бритвы, пока примерно такой же ширины по длине всей толстой кишки получается.
Выровнять толстой кишки подвергать люмен и сгладить ткани полностью с помощью гибкой иглы гаважа. Добавить больше PBS, если это необходимо, чтобы сохранить ткани влажными на протяжении всей процедуры. Удалите избыток PBS с помощью бумажной салфетки.
С шприцем и иглой gavage, добавьте 10%neutral буферный раствор формалина на 2 до 3 минут для того чтобы зафиксировать и сплющить ткань, после этого используйте прямые forceps для того чтобы схватить конец дистальной двоеточия и закрутить двоеточие в концентрические круги от дистального к проксимическому концу. Вставьте 27 калибровочных иглы, чтобы приколоть толстой кишки в середине и держать его швейцарской форме рулона, а затем поместить швейцарский рулон в встраивающий кассету внутри гистологического контейнера образца ориентации ткани параллельно с кассетой. Зафиксните ткань в 10%нейтральном буферном растворе формалина на ночь при четырех градусах по Цельсию.
После ночной фиксации, мыть ткани три раза с PBS. Добавьте 70% этанола до процесса встраивания парафина и удалите иглу из швейцарского рулона перед началом работы. Ткань может храниться в этаноле при комнатной температуре до встраивания парафина.
После открытия отсканированных изображений в программном обеспечении обработки изображений убедитесь, что видна вся толстая кишка и что отсутствуют области образца. Активируйте изображение метки и масштабируйте инструменты бара, чтобы правильно идентифицировать отсканированные слайды, нажав на изображение метки. Откройте инструмент аннотации, нажав на аннотации и создать три различных слоя, нажав новый слой для количественной оценки общей длины швейцарского рулона, воспаление или травмы, и эрозии или язвы.
Выберите другой цвет для каждого слоя, нажав цвет слоя. Измерьте длину каждого слоя или категории, нажав на перо инструмент, чтобы нарисовать линию после мышечной слизистой оболочки, перемещая указатель по мере необходимости, чтобы визуализировать прилегающую область для анализа. Просмотр изображения на 400 микрометровый зум, чтобы облегчить адекватную визуализацию слизистой оболочки мускулистых.
Каждый раз, когда перо останавливается, будет генерироваться небольшая область нового слоя. Его можно визуализировать и редактировать с помощью вкладки регионов слоя. Просмотрите общую длину, воспаление или травмы, а также эрозии или язвы измеряется с помощью слизистой оболочки мышечной массы в качестве эталона.
После того, как все слои определены, экспорт данных с помощью экспортной сетки на кнопку текстового файла внутри вариантов регионов слоя. Откройте текстовые файлы и копируйте данные в программное обеспечение электронной таблицы. Итого все сегменты из каждого региона и рассчитать процент травмы и язвы по отношению к общей длине.
Рассмотрим три основные характеристики для расчета гистологического колита оценка и оценить тяжесть заболевания. Проверьте здоровую слизистую оболочку кишечника, которая характеризуется организованными эпителиальными клетками в склепе светимой оси, ламина проприа с несколькими иммунными клетками и субджацентной мышечной слизистой оболочкой. Далее проверьте воспаление или травму, которая характеризуется эпителиальными склепами, которые затуманены или частично отсутствуют эпителиальные клетки и мукозальное воспаление с нейтрофиловым проникновением в склепы.
Наконец, проверьте наличие эрозии или язвы, которая характеризуется областями, лишенными поверхностного эпителия или областями, полностью не имеющими эпителия с или без связанных лейкоцитов. Чтобы проиллюстрировать надежность этого гистологического анализа оценки колита в контексте слизистой оболочки, 2,5%DSS вводили в питьевой воде восьми мышей дикого типа C57BL6 в течение пяти дней, а затем период восстановления с обычной водой в течение пяти дней. Вес тела оставался неизменным во время острого введения DSS, но резко снизился, когда мыши начали пить обычную воду из-под крана.
Кровь и мягкий стул появились после трех дней администрации DSS и продолжались до восьмого дня эксперимента. Эти наблюдения показали, что наиболее пагубные последствия воздействия ДСС наблюдались в период восстановления между пятью и восемью днями. Измерение длины толстой кишки на 10-й день подтвердило значительное сокращение в конце эксперимента.
Колоны были собраны в день ноль, два, пять, семь, восемь и 10, чтобы парафин швейцарских рулонов. Ткань была окрашена с H'E и высокой четкости сканирования были проанализированы для расчета гистологического колита оценка и процент травмы и язвы. Нормальная архитектура склепа наблюдалась у необработанных мышей.
После двух дней администрации DSS, набор иммунных клеток наблюдался. На пятый день эпителиальные клетки появляются поврежденные и было проникновение нейтрофилов через эпителий, связанные с эпителиальной травмы. С пяти до восьми дней наблюдались эпителиальные потери с воспалением и язвой.
На 10-й день эпителиальные клетки начали восстанавливаться и заселяться язвенными участками, медленно восстанавливая слизистую оболочку толстой кишки. При попытке этого протокола, важно создать правильно ориентированных и хорошо сохранившихся швейцарский рулон, а также правильно определить слизистой воспаления или травмы и язвы или эрозии. Этот метод может быть использован для количественной оценки травм по всей длине слизистой оболочки толстой кишки в других моделях колита, таких как TMS или Т-клеток передачи модели.
