L'analisi sistematica del punteggio è una tecnica per valutare la lesione della mucosa, facilitando l'interpretazione istologica che può essere eseguita da ricercatori addestrati. I principali vantaggi di questo metodo è che è gratuito e facile da usare. Consente l'analisi quantitativa dei dati istologici ottenuti dall'intestino dei topi con colite.
Questo protocollo fornisce un modo rapido e riproducibile per interpretare la gravità della malattia dell'intero colon, necessaria per confrontare le malattie da animali di diversa origine genetica. Per la preparazione dei tessuti, è importante organizzare tutti i reagenti e i materiali. Iniziare posizionando un mouse eutanasiato su un cuscinetto di sezionatura in posizione supina e immobilizzando le estremità del mouse utilizzando aghi da 1,5 pollici calibro 20.
Usando forcep e forbici, fare una piccola incisione sulla pelle addominale e tirarla di lato per esporre il peritoneo, quindi aprire la cavità addominale con un'incisione della linea mediana nel peritoneo dall'osso pubico ai lati dell'addome. Rimuovere con cura tessuti e organi fino a visualizzare l'intestino crasso. Tagliare l'osso pelvico su entrambi i lati del colon per visualizzare completamente l'organo, estendendosi dall'ano verso il cieco.
Rimuovere delicatamente grasso, piccole vene e arterie attaccate al colon mentre si seziona attentamente l'organo, tagliando solo prossimale all'ano e distale al cieco. Sciacquare con cura i due punti con PBS per rimuovere il contenuto fecale utilizzando un ago flessibile di gavage in plastica inserito attraverso l'ano. Posizionare il colon in linea retta e aprirlo longitudinalmente lungo l'arteria mesenterica.
Bisect il colon longitudinalmente dal distale all'estremità prossimale. Utilizzare metà del tessuto per l'analisi istologica e l'altra metà per western blot, PCR, o arrotolato in un secondo rotolo svizzero per microscopia a immunofluorescenza congelata fresca. Tagliare il tessuto extra dal colon prossimale con una lama di rasoio fino a ottenere approssimativamente la stessa larghezza lungo la lunghezza dell'intero colon.
Allineare i due punti per esporre il lume e appiattire completamente il tessuto utilizzando un ago di gavage flessibile. Aggiungere più PBS se necessario per mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura. Rimuovere il PBS in eccesso utilizzando una salvietta di carta.
Con una siringa e un ago di gavage, aggiungere una soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per due o tre minuti per fissare e appiattire il tessuto, quindi utilizzare pinzture dritte per afferrare l'estremità del colon distale e ruotare il colon in cerchi concentrici dall'estremità distale a quello prossimale. Inserire un ago calibro 27 per fissare i due punti al centro e mantenere la sua forma a rotolo svizzero, quindi posizionare il rotolo svizzero in una cassetta di incorporamento all'interno di un contenitore di campioni istologici che orienta il tessuto in parallelo rispetto alla cassetta. Fissare il tessuto in soluzione di formalina tamponata neutra al 10% durante la notte a quattro gradi Celsius.
Dopo la fissazione notturna, lavare il tessuto tre volte con PBS. Aggiungere il 70% di etanolo prima del processo di incorporamento della paraffina e rimuovere l'ago dal rotolo svizzero prima di procedere. Il tessuto può essere conservato in etanolo a temperatura ambiente fino all'incorporamento di paraffina.
Dopo aver aperto le immagini digitalizzate nel software di elaborazione delle immagini, verificare che tutti i due punti siano visibili e che non vi siano aree mancanti dell'esempio. Attivare l'imager dell'etichetta e gli strumenti della barra di ridimensiona per identificare correttamente le diapositive digitalizzate facendo clic su Imager etichette. Apri lo strumento annotazioni facendo clic sulle annotazioni e crea tre livelli diversi facendo clic su un nuovo livello per quantificare la lunghezza totale del rotolo svizzero, l'infiammazione o la lesione e l'erosione o l'ulcerazione.
Scegliere un colore diverso per ogni livello facendo clic sul colore del livello. Misurare la lunghezza di ogni livello o categoria facendo clic sull'utensile penna per disegnare una linea seguendo la mucosa muscolare, spostando il puntatore in base alle esigenze per visualizzare l'area adiacente per l'analisi. Visualizza l'immagine con uno zoom di 400 micrometri per facilitare un'adeguata visualizzazione della mucosa muscolare.
Ogni volta che la penna viene arrestata, verrà generata una nuova piccola area di livello. Può essere visualizzato e modificato con la scheda aree livello. Esaminare la lunghezza totale, l'infiammazione o la lesione e l'erosione o l'ulcerazione misurata utilizzando la mucosa muscolare come riferimento.
Una volta definiti tutti i livelli, esportate i dati utilizzando il pulsante esporta griglia in file di testo all'interno delle opzioni delle aree del livello. Aprire i file di testo e copiarli in un software per fogli di calcolo. Totale tutti i segmenti di ciascuna regione e calcolare la percentuale di lesioni e ulcerazioni rispetto alla lunghezza totale.
Considerare tre caratteristiche principali per calcolare il punteggio di colite istologica e valutare la gravità della malattia. Verificare la presenza di mucosa intestinale sana, caratterizzata da cellule epiteliali organizzate nell'asse luminare della cripta, lamina propria con poche cellule immunitarie e mucosa muscolare subjacente. Successivamente, controllare l'infiammazione o la lesione, che è caratterizzata da cripte epiteliali attenuate o parzialmente mancanti e infiammazione della mucosa con infiltrazione di neutrofili nelle cripte.
Infine, verificare la presenza di erosione o ulcerazione, che è caratterizzata da aree prive di epitelio superficiale o aree completamente prive di cripte di epitelio con o senza leucociti associati. Per illustrare l'affidabilità di questa analisi istologica del punteggio della colite nel contesto dei danni alla mucosa, il 2,5%DSS è stato somministrato nell'acqua potabile di otto topi di tipo selvatico C57BL6 per cinque giorni, seguito da un periodo di recupero con acqua regolare per cinque giorni. Il peso corporeo è rimasto costante durante la somministrazione acuta di DSS, ma è diminuito drasticamente quando i topi hanno iniziato a bere acqua di rubinetto regolare.
Sangue e feci morbide apparvero dopo tre giorni di somministrazione del DSS e continuarono fino all'ottavo giorno dell'esperimento. Queste osservazioni hanno suggerito che gli effetti più dannosi dell'esposizione al DSS sono stati osservati durante il periodo di recupero tra i giorni cinque e otto. La misurazione della lunghezza del colon il giorno 10 ha confermato un significativo accorciamento alla fine dell'esperimento.
I colons sono stati raccolti al giorno zero, due, cinque, sette, otto e 10 per fare rotoli svizzeri di paraffina. Il tessuto è stato macchiato di H&E e sono state analizzate scansioni ad alta definizione per calcolare il punteggio di colite istologica e la percentuale di lesioni e ulcerazioni. La normale architettura della cripta è stata osservata nei topi non trattati.
Dopo due giorni di somministrazione del DSS, è stato osservato il reclutamento delle cellule immunitarie. Il quinto giorno, le cellule epiteliali appaiono danneggiate e c'è stata un'infiltrazione di neutrofili attraverso l'epitelio associata a lesioni epiteliali. Dal quinto all'ottavo giorno, sono state osservate aree di perdita epiteliale con infiammazione e ulcerazione.
Il giorno 10, le cellule epiteliali iniziarono a rigenerarsi e ripopolare le aree ulcerate, ripristinando lentamente la mucosa colonica. Quando si tenta questo protocollo, è importante creare un rotolo svizzero adeguatamente orientato e ben conservato, nonché identificare correttamente l'infiammazione o la lesione della mucosa e l'ulcerazione o l'erosione. Questo metodo può essere utilizzato per valutare quantitativamente la lesione lungo l'intera lunghezza della mucosa colonica in altri modelli di colite, come il TMS o il modello di trasferimento delle cellule T.
