体系的なスコア分析は、粘膜損傷を評価するための技術であり、訓練を受けた研究者が行うことができる組織学的解釈を促進する。この方法の主な利点は、無料で使いやすいということです。それは大腸炎を有するマウスの腸から得られる組織学的データの定量的な分析を可能にする。
このプロトコルは、異なる遺伝的背景を持つ動物の疾患を比較するために必要な結腸全体の疾患の重症度を解釈するための迅速かつ再現可能な方法を提供する。組織の準備のために、すべての試薬および材料を整理することが重要である。まず、サピン位置の解剖パッドに安楽死させたマウスを置き、20ゲージ1.5インチの針を使用してマウスの四肢を固定化します。
鉗子とはさみを使用して、腹部の皮膚に小さな切開を行い、腹膜を露出させるために側面に引っ張り、次に陰骨から腹部の側面に腹膜の中線切開で腹腔を開く。大腸が可視化されるまで、組織や臓器を慎重に除去します。大腸の両側の骨盤骨を切って臓器を完全に視覚化し、アヌスから盲腸に向かって伸びる。
慎重に臓器を解剖しながら結腸に取り付けられた脂肪、小さな静脈、動脈を穏やかに取り除き、肛門に近位に切り、盲腸に遠位する。慎重に、アヌスを介して挿入柔軟なプラスチックガバジ針を使用して便内容を除去するためにPBSで結腸を洗い流します。結腸を直線に配置し、腸間膜動脈に沿って縦方向に開きます。
遠位から近位端まで、結腸を縦方向に二分する。組織の半分を組織学的分析に使用し、残りの半分はウェスタンブロット、PCR、または新鮮な凍結免疫蛍光顕微鏡のために第2のスイスロールにロールします。カミソリの刃で近位結腸から余分な組織をトリミングし、結腸全体の長さに沿ってほぼ同じ幅が得られるまで。
大腸を合わせて内腔を露出させ、柔軟なガバジ針を使用して組織を完全に平らにします。手順を通して組織を湿らせた保つために必要に応じて、より多くのPBSを追加します。紙拭きで余分なPBSを取り除きます。
注射器とガベージ針で、組織を固定して平らにするために2〜3分間10%中性緩衝ホルマリン溶液を加え、ストレート鉗子を使用して遠位結腸の端をつかみ、遠位から近位端まで同心円に結腸をねじります。27ゲージの針を挿入して結腸を真ん中に固定し、スイスのロール形状を保持し、スイスロールをカセットに対して平行して組織を配向させる組織学的標本容器の中に埋め込みカセットに入れます。摂氏4度で一晩10%中性緩衝ホルマリン溶液で組織を固定します。
一晩固定した後、PBSで組織を3回洗浄する。パラフィン埋め込みプロセスの前に70%エタノールを加え、スイスロールから針を取り除いてから続行します。組織は、パラフィン埋め込みまで室温でエタノールに保存することができる。
スキャンした画像を画像処理ソフトウェアで開いた後、コロン全体が表示され、サンプルの欠落領域がないことを確認します。ラベル イメージャーとスケール バー ツールをアクティブ化し、ラベル イメージャーをクリックしてスキャンしたスライドを適切に識別します。注釈をクリックして注釈ツールを開き、新しいレイヤーをクリックして、スイスロールの全長、炎症または損傷、および浸食または潰瘍を定量化することで、3 つの異なるレイヤーを作成します。
レイヤーの色をクリックして、レイヤーごとに異なる色を選択します。ペンツールをクリックして筋肉筋粘膜の後に線を引き、必要に応じてポインタを動かして、解析のために隣接する領域を視覚化することで、各レイヤーまたはカテゴリの長さを測定します。400マイクロメートルズームで画像を見て、筋肉筋粘膜の適切な視覚化を容易にします。
ペンが停止するたびに、小さなレイヤー領域が生成されます。レイヤー領域タブで視覚化および編集できます。筋膜粘膜を参考に、全長、炎症または傷害、および浸食または潰瘍を確認します。
すべてのレイヤーを定義したら、レイヤー領域オプション内のテキストファイルボタンにエクスポートグリッドを使用してデータをエクスポートします。テキスト ファイルを開き、データをスプレッドシート ソフトウェアにコピーします。各領域のすべてのセグメントを合計し、全長に対する傷害および潰瘍の割合を計算します。
組織学的大腸炎スコアを計算し、疾患の重症度を評価する3つの主な特徴を考慮する。腸内粘膜の健康な検査は、陰窩の上皮細胞が、免疫細胞が少なく、筋肉質下粘膜が少ない層状細胞を特徴とする。次に、炎症または傷害をチェックし、上皮細胞を減衰または部分的に欠けている上皮性陰窩および陰窩への好中球浸潤による粘膜炎症を特徴とする。
最後に、浸食または潰瘍の存在を確認し、表面上皮を欠いた領域または関連する白血球の有無にかかわらず上皮窩窩の完全に欠けている領域によって特徴付けられる。粘膜損傷の文脈におけるこの組織学的大腸炎スコア分析の信頼性を例示するために、2.5%DSSを8匹のC57BL6野生型マウスの飲料水中に5日間投与し、続いて5日間の規則的な水で回復期間を行った。DSSの急性投与中は体重は一定であったが、マウスが通常の水道水を飲み始めると劇的に減少した。
血液と軟部便はDSS投与の3日後に現れ、実験の8日目まで続いた。これらの観察は、DSSへの暴露の最も有害な影響が5日目から8日目の間の回復期間中に観察されたことを示唆した。10日目における結腸長の測定は、実験終了時に有意な短縮を確認した。
コロンはゼロ、2、5、7、8、10で収穫され、パラフィンスイスロールを作りました。組織をH&Eで染色し、高精細スキャンを分析し、組織学的大腸炎スコアと傷害および潰瘍の割合を計算した。正常な暗号アーキテクチャは、未処理マウスで観察された。
DSS投与の2日後、免疫細胞のリクルートが観察された。5日目には、上皮細胞が損傷を受けたように見え、上皮損傷に関連する上皮全体に好中球が浸透した。5日目から8日目まで、炎症および潰瘍による上皮喪失の領域が観察された。
10日目、上皮細胞は潰瘍化領域を再生し、再移植し始め、ゆっくりと大腸粘膜を回復させた。このプロトコルを試みるとき、適切に指向し、よく保存されたスイスロールを作成するだけでなく、正しく粘膜の炎症や傷害や潰瘍や浸食を識別することが重要です。この方法は、TMSまたはT細胞転写モデルのような大腸炎の他のモデルにおける大腸粘膜の全長に沿った傷害を定量的に評価するために使用することができる。
