منذ فترة طويلة تم استخدام Stentor coeruleus ككائن حي نموذجي لفهم التجديد أحادي الخلية. في حين أن الجدول الزمني للتجديد المورفولوجي البصري معروف ، إلا أن الجدول الزمني للتجديد الوظيفي لا يزال غير معروف. يتتبع هذا الفحص حركية سكان المركز الذين يخضعون للتجديد المتزامن بحيث يمكن تحديد وظيفة استرداد الخسارة.
يمكن تكييفه للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى. سيؤدي عدم وجود ختم آمن لغرفة التصوير إلى تسرب الآبار إلى بعضها البعض أو تشكل فقاعات الهواء داخل الآبار. بالنسبة للباحثين غير المطلعين على استخدام فواصل السيليكون ، نوصي بشدة بأن يتم سحب PSW أو أي وسيط نظيف آخر في كل بئر من الآبار لاختبار التسرب قبل الاستخدام.
يتم عرض بناء غرف العينة بشكل أسهل من وصفه شفهيا. كما هي عملية استخراج أنماط الحركة من بيانات الفيديو المكتسبة. للبدء ، قم بقطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر.
استخدم لكمة كاملة لإنشاء آبار دائرية تترك مساحة كافية بين الآبار المجاورة لضمان ختم جيد. بدء تجديد الجهاز الفموي عن طريق احتضان الخلايا المنتفخة coeruleus في 10٪ السكروز أو 2٪ uria لمدة دقيقتين. ثم يغسل ثلاث مرات مع وسط طازج.
ماصة بلطف ما يقرب من 10 دعامات في كل بئر. الحرص على مطابقة حجم العينة مع حجم البئر قدر الإمكان. أغلق الآبار عن طريق خفض قطعة من زجاج الغطاء برفق فوق الآبار بدءا من حافة واحدة.
استخدم جسما ضيقا ومرنا قليلا ، مثل طرف ماصة 10 ميكرولتر للضغط لأسفل على زجاج الغطاء حيث يلامس ورقة السيليكون لضمان ختم جيد. ضع العينة على مرحلة المجهر واضبط المجهر على أدنى تكبير متاح بحيث يتناسب المرء بشكل جيد مع الإطار. ابدأ الفاصل الزمني واحصل على فيديو مدته عشر ثوان بمعدل 30 إطارا في الثانية من كل بئر في كل نقطة زمنية.
للمعايرة، احصل على صورة واضحة لشريحة معايرة أو مسطرة واضحة في نفس إعدادات التكبير مثل مقاطع الفيديو. باستخدام أي برنامج لعرض الصور ، قم بحساب عدد وحدات البكسل بين علامات المسافة المادية المعروفة. قم بتنزيل البرنامجين النصيين وخلايا التتبع وتنظيف الآثار إلى موقع يسهل تذكره على الكمبيوتر ونقل مقاطع فيديو البيانات إلى هذا الكمبيوتر أيضا.
تنظيم مقاطع فيديو البيانات في مجلدات. واحد لكل نقطة زمنية. استخدم خلايا تتبع البرنامج النصي لإجراء تتبع تلقائي للخلايا في مقاطع فيديو البيانات عن طريق فتح خلايا المسار وتشغيل البرنامج النصي اختر إضافة إلى المسار "إذا طلب منك ذلك من خلال نافذة منبثقة والتي لن تحدث عادة إلا عند تشغيل البرنامج النصي لأول مرة من مجلد معين.
عند المطالبة، حدد مقطع فيديو بيانات واحدا أو أكثر لبدء التتبع. انتقل إلى مقاطع فيديو البيانات وبمجرد الرضا عن قائمة الملفات ، انقر فوق فتح"لرفض الآثار الشاذة أو الخاطئة يدويا ، افتح الآثار النظيفة في نافذة محرر MATLAB بالنقر المزدوج على الملف. في المطالبة ، حدد إخراج مجلد البيانات بواسطة خلايا التعقب.
انتقل إلى أحد المجلدات التي تم إنشاؤها وحدده. عند المطالبة، أدخل واحدا للاحتفاظ بالتتبع وصفرا لرفض التتبع. ثم اضغط على Enter للانتقال إلى التتبع التالي.
ابدأ بتنزيل البرنامج النصي بعنوان مؤامرات السباغيتي. افتح البرنامج النصي وقم بتشغيله. عندما تنبثق نافذة مستعرض الملفات مع المطالبة، حدد المجلد المراد فتحه.
انتقل إلى مجلد إحدى النقاط الزمنية. عند المطالبة، المعايرة، ما هو عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر؟ اكتب قيمة المعايرة واضغط على مفتاح الإدخال Enter.
اضبط محاور المؤامرة حسب الضرورة عن طريق تغيير السطر 55 من البرنامج النصي ، والذي يتم تعيينه افتراضيا إلى RR يساوي أربعة. لتضمين دائرة نصف قطرها تصل إلى أربعة ملليمترات. حفظ المؤامرة.
تظهر النتائج الحركة الجماعية لسكان الخلايا الجذعية في ساعتين وثلاث وسبع وثماني ساعات من عملية تجديد الجهاز الفموي. تظهر هذه المؤامرات كلا من الزيادة المتوقعة في عدد الأفراد المتحركين والزيادة أربعة أضعاف في نطاق الخلايا الأكثر حركة داخل السكان. أسرع خلايا السباحة ، إذا بدأت بالقرب من الحافة ، يتم تقييدها من السباحة بالكامل في خط مستقيم ويبدو نطاق حركتها أصغر.
تم تصنيف خلايا المسالك إلى ثلاث فئات متميزة ، غير متحركة مع عدم وجود ثبات مرئي ، وغير متحركة مع ثبات مرئي ، ومتحركة. أظهرت النتيجة رسما بيانيا مكدسا يلخص عدد الخلايا النسبية عبر هذه الفئات كدالة لنا في التجديد. في أوقات لاحقة ، تم العثور على عدد كبير من الخلايا في مستعمرات ذات صيام مرئي يشير بقوة إلى أنها استكشفت البيئة وربطت بشكل تفضيلي بالقرب من الآخرين من نوعهم.
من المهم اختيار أبعاد بئر العينة التي تعمل بشكل جيد مع coeruleus السدادة التي يبلغ حجمها حوالي ملليمتر واحد. ويشمل ذلك سمك فاصل السيليكون 5/16 بوصة في القطر ، و 10 خلايا لكل بئر. يجب ضبط هذه الأرقام عند تكييف هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا الأخرى.
يمكن إجراء هذا الفحص بالاقتران مع RNA-I للتحقيق في تجديد الأنماط الظاهرية المختلفة للدعامات ومقارنتها.
