스텐터 코에룰루스는 오랫동안 단세포 재생을 이해하기 위한 모델 유기체로 사용되어 왔다. 시각적 형태학적 재생을 위한 타임라인은 알려져 있지만, 기능적 재생을 위한 타임라인은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 분석은 손실 기능의 회복이 정량화될 수 있도록 동기화된 재생을 겪는 중심 집단의 운동성을 추적한다.
다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 적응될 수 있다. 이미징 챔버의 안전한 씰이 없으면 웰이 서로 누출되거나 웰 내부에 기포가 형성됩니다. 실리콘 스페이서의 사용에 익숙하지 않은 연구자의 경우 PSW 또는 기타 깨끗한 매체를 각 웰에 피펫팅하여 사용 전에 누출을 테스트하는 것이 좋습니다.
샘플 챔버의 구성은 구두로 묘사 된 것보다 쉽게 표시됩니다. 획득한 비디오 데이터로부터 운동성 패턴을 추출하는 과정도 마찬가지이다. 시작하려면 현미경 슬라이드보다 높이와 너비가 약간 작은 250 마이크로 미터 두께의 실리콘 스페이서 시트 조각을 자릅니다.
전체 펀치를 사용하여 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 둔 원형 웰을 만들어 좋은 씰을 확보하십시오. 2 분 동안 10 % sucrose 또는 2 % uria에서 스텐터 coeruleus 세포를 배양하여 구강 장치의 재생을 시작하십시오. 그런 다음 신선한 매체로 세 번 씻으십시오.
각 웰에 약 10 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 부피와 가능한 한 가깝게 일치시키도록주의하십시오. 한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각을 부드럽게 내려 웰을 닫으십시오.
10 마이크로 리터 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 좋은 밀봉을 보장합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 현미경을 사용 가능한 가장 낮은 배율로 설정하여 프레임에 잘 맞도록 합니다. 시간 경과를 시작하고 각 시점에서 각 웰의 초당 30 프레임으로 10 초 비디오를 획득하십시오.
보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다. 두 스크립트를 다운로드하고, 셀을 추적하고, 추적하고, 추적한 흔적을 컴퓨터에서 기억하기 쉬운 위치로 이동하고, 데이터 비디오를 이 컴퓨터로 전송합니다.
데이터 비디오를 폴더로 구성합니다. 각 시점마다 하나씩. 스크립트 트랙 셀을 사용하여 트랙 셀을 열고 스크립트 경로 추가를 실행하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다."팝업 창이 나타나면 일반적으로 지정된 폴더에서 스크립트를 처음 실행할 때만 발생합니다.
메시지가 표시되면 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하여 추적을 시작합니다. 데이터 비디오로 이동하여 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오."변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부하려면 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 깨끗한 추적을 엽니 다. 프롬프트에서 트랙 셀별로 출력 된 데이터 폴더를 선택하십시오.
생성 된 폴더 중 하나로 이동하여 선택하십시오. 메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 하나를 입력하고 추적을 거부하려면 0을 입력합니다. 그런 다음 Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다.
스파게티 플롯이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 파일 브라우저 창이 프롬프트와 함께 나타나면 열 폴더를 선택합니다.
시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 메시지가 표시되면 보정, 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까? 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
기본적으로 RR이 네 개로 설정된 스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다. 최대 네 밀리미터의 반경을 포함합니다. 플롯을 저장합니다.
결과는 구강 장치 재생 과정으로 두 시간, 세 시간, 일곱 시간 및 여덟 시간에 스텐터 세포 집단의 집단적 운동성을 보여줍니다. 이 플롯은 운동성 개체의 수의 예상 증가와 집단 내에서 가장 운동성 세포의 범위에서 네 배 증가를 모두 보여줍니다. 가장 빠른 수영 셀은 가장자리 가까이에서 시작하면 직선으로 완전히 수영하는 것이 제한되며 이동 범위가 작아 보입니다.
관 세포는 세 가지 별개의 범주로 분류되었는데, 눈에 보이는 홀드가 빠르지 않은 비운동성, 가시적 인 보류가 빠른 비운동성, 그리고 모타일로 분류되었다. 결과는 이러한 범주에 걸친 상대적 셀 수를 재생성에 대한 함수로 요약하는 누적 히스토그램을 보여주었습니다. 나중에, 상당한 수의 세포가 눈에 보이는 보류 금식을 가진 식민지에서 발견되었는데, 이는 그들이 환경을 탐험하고 그들의 종류의 다른 사람들 근처에 우선적으로 붙어 있음을 강하게 암시합니다.
크기가 약 한 밀리미터 인 스텐터 코에룰루스에 대해 잘 작동하는 샘플 우물 치수를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에는 직경 5/16 인치의 실리콘 스페이서 두께와 웰 당 10 개의 셀이 포함됩니다. 이 숫자는 다른 세포 유형에 대해이 프로토콜을 적용 할 때 조정되어야합니다.
이 분석은 상이한 스텐터 표현형의 재생을 조사하고 비교하기 위해 RNA-I와 함께 수행될 수 있다.
