يصف هذا البروتوكول إعداد عينة الحمض النووي الريبي وإعداد NMR لقياسات تشتت الاسترخاء البروتون R1rho لفحص التبادل التأكيدي في جزيئات الحمض النووي الريبي. وبما أن البروتونات يتم فحصها، فإن الطريقة لا تحتاج إلى وضع علامات نظائرية ويمكنها الوصول إلى الميزات الهيكلية مثل الاقتران الأساسي المتحول مباشرة. المصصة هو وحدات تماما بمعنى أن R1rho الاسترخاء التشتت يمكن قياسها حتى لو تم إنتاج العينة مع طريقة مختلفة.
ابدأ بإعداد عينة البلازميد وإعداد نسخة في المختبر ورد فعل الانقسام كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تمييع ميكرولتر واحد من العينة عشرة أضعاف في تحميل الحل.
وتشغيل ميكرولتر واحد على هلام الصفحة denaturing. إذا كان رد فعل الانقسام ناجحا، قم بتحجيم التفاعل مع الحجم المطلوب وتشغيله بين عشية وضحاها. ثم تشغيل هلام الصفحة آخر denaturing وتقييم ما إذا كان قد تم الانتهاء من رد فعل الانقسام.
في حالة عدم اكتمال الانقسام، سخني محلول التفاعل في ميكروويف تقليدي عند 450 واط لمدة 15 ثانية. ثم يبرد الحل ببطء إلى 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لإعادة توجيه الحمض النووي الريبي ودليل الانقسام. ولاحظ تشكيل عجلة جديدة.
إضافة المزيد من البيروفيوسفاتاز غير العضوية وRNase H.Incubate رد الفعل لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. ثم تأكد من الانتهاء من رد فعل الانقسام مع إزالة النبج الصفحة. عند اكتمال رد فعل الانقسام RNase H، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي 50 ملليمولار.
ودوامة تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. وتركيز الحل لحجم حقنها في نظام HPLC لتنقية.
قبل إضافة عينة مركزة ومنقى إلى أنبوب NMR، تنظيف الأنبوب عن طريق التنظيف مع وفرة المياه. ثم RNase إزالة التلوث الكاشف، والمياه، و 95٪ الإيثانول. بعد الشطف النهائي بالماء، اتركيه لتجف.
شطف المكبس بالماء واستخدام مسح خالية من الوبر لتنظيف مع كاشف إزالة التلوث RNase و 95٪ الإيثانول. بعد تجفيف الأنبوب والمغطاس، أضف 10٪ D2O إلى عينة NMR. استخدام تلميح ماصة كبيرة لنقل عينة الحمض النووي الريبي في أنبوب NMR، تتدفق على طول الجانب من جدار أنبوب.
أدخل المكبس في الأنبوب عن طريق دفعه لأسفل مع حركة التواء سريعة لإزالة فقاعات الهواء ، ثم سحب المكبس ببطء دون إنشاء فقاعات هواء جديدة. وإصلاحه مع فيلم شمع البارافين. إنشاء مجموعة بيانات جديدة على أساس مجموعة بيانات الكربون البروتون العطرية HSQC المستخدمة على عينات الحمض النووي الريبي المسمى بالكامل لتخصيص الحمض النووي الريبي.
تعيين المعلمات العامة والمعلمات الخاصة RD. ثم تعيين البروتون تدور قفل السلطة إلى 1.2 كيلوهرتز للاختبار. إنشاء قائمة vd اختبار مع إدخال واحد فقط، صفر ميلي ثانية، تعيين TDF1 إلى واحد، وتحديث D30 لتشغيل طيف اختبار.
بعد إعداد قائمة VD اختبار تحديث D30 و TDF1. ورسم كثافة الذروة لأطوال قفل تدور مختلفة. تحديد طول قفل الدوران الذي تنخفض فيه كثافة الذروة الأصلية إلى الثلث.
من نتيجة تشغيل الاختبار، قم بإنشاء قائمة vd النهائية لاستخدامها في التجربة. حدد عدد عمليات المسح الضوئي بحيث يكون لأضعف قمة في القائمة نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 10. تظهر هنا نتائج العديد من ردود الفعل الانقسامية للنصوص المترادف.
تم إنشاء 20 النيوكليوتيدات الهدف الجيش الملكي النيبالي في رد فعل ناجح. وأسفرت ردود الفعل غير الناجحة عن انشقاق غير كامل ومفشل للعينة. كشفت حقن HPLC من عينة الحمض النووي الريبي ذروة للجيش الملكي النيبالي الهدف النقي في 38 دقيقة.
في حين تم فصل المنتجات الأطول والأقصر بشكل جيد عن ذروة الاهتمام. أظهر تحليل دبوس شعر الحمض النووي الريبي أن عدد بروتونات إيمينو الملاحظة يطابق عدد بروتونات إيمينو المتوقعة من محاكاة البنية الثانوية. أظهر طيف الكربون البروتون HSQC من الرنين العطري للجيش الملكي النيبالي أربع إشارات بعد طيه.
وثلاث إشارات فقط قبل طيها. في ممثل على منحنيات الرنين التي تم الحصول عليها لاثنين من ذرات H8 مختلفة واثنين من دبابيس الشعر الحمض النووي الريبي الاصطناعية المختلفة، والخبرات G6H8 تبادل تأكيدي. في حين أن A4H8 لا.
بالنسبة إلى G6H8، تم اختيار قوى قفل الدوران الملونة وتسجيل بيانات الرنين. في بناء CG حيث التبادل بطيء، قيم الصف R1rho مقابل مؤامرة تعويض عرض بالفعل عدم تماثل طفيف من المنحنى، مما يدل على علامة على الفرق التحول الكيميائي دلتا أوميغا. هذا يصبح أكثر وضوحا في R2 بالإضافة إلى مؤامرة ريكس حيث تتم إزالة مساهمة R1.
من ناحية أخرى ، فإن بناء GC الخبرات أسرع تبادل وقيم R1rho مقابل مؤامرة تعويض قدم منحنى أوسع حيث استخراج أوميغا دلتا يصبح أقل وضوحا حتى في مؤامرة R2 زائد ريكس. وبمجرد توضيح ديناميكيات الحمض النووي الريبي، يمكن وصف الولايات ومحاصرتها. ويمكن، على سبيل المثال، اختبار هذه الدول المحاصرة في المقايسات البيولوجية.
هذه الطريقة تسمح لنا لمراقبة وظيفية، والتحولات الاقتران قاعدة ذات الصلة في مجمع ميرنا ميكرورنا النشطة، وإعادة ترتيب حلقة في الحمض النووي الريبي ريبوسومال، والاستقرار زوج قاعدة من على انتفاخات النيوكليوتيدات واحد.
