¹H R_{1 +} RNA 放松分散实验样品制备和设置的实用方面

该协议描述了质子R1rho放松分散测量的RNA样品制备和NMR设置，以检查RNA分子的确认交换。由于质子被探测，该方法不需要同位素标记，可以直接访问结构特征，如转移的基础配对。移液器是相当模块化的意义，R1rho放松分散可以测量，即使样品是用不同的方法产生的。

首先准备质粒样本，并设置体外转录和反应，如文本手稿中所述。将反应在37摄氏度下孵化一小时。然后在加载溶液中稀释样品的一微升。

并在变性的 PAGE 凝胶上运行一个微升。如果反应成功，将反应缩放到所需的体积中，并在一夜之间运行。然后运行另一个变性 PAGE 凝胶，并评估反应是否已经完成。

如果不完整，将反应溶液在传统微波炉中加热 450 瓦，加热 15 秒。然后将溶液缓慢冷却到 37 摄氏度 40 分钟，重新对 RNA 和导引进行重新命名。并注意形成一个新的沉淀。

加入更多的无机热磷酸盐和RNase H.孵化反应一到三个小时在37摄氏度。然后确认完成反应与变性页面。当 RNase H 反应完成时，通过将 EDTA 添加到 50 毫摩尔的最终浓度来抑制反应。

彻底的漩涡。通过 0.2 微米注射器过滤器过滤解决方案。将溶液集中到可注入 HPLC 系统的体积中进行净化。

在将浓缩和纯化样品添加到 NMR 管中之前，用丰富的水冲洗清洁管。然后是 RNase 净化试剂、水和 95% 乙醇。最后用水冲洗后，让它干燥。

用水冲洗柱塞，使用无绒毛湿巾用 RNase 净化试剂和 95% 乙醇清洁。干燥管子和柱塞后，在 NMR 样品中加入 10%D2O。使用大移液器尖端将RNA样本转移到NMR管中，沿着管壁的一侧流动。

将柱塞插入管中，用快速扭曲的运动将其推倒以消除气泡，然后缓慢地将柱塞拉起，而不会产生新的气泡。用石蜡薄膜修复它。根据用于 RNA 分配的全标记 RNA 样本上使用的芳香质子碳 HSQC 数据集创建新数据集。

设置一般参数和 RD 特定参数。然后将质子旋转锁功率设置为 1.2 千赫用于测试。生成只有一个条目的测试 vd 列表，零毫秒，将 TDF1 设置为 1，并更新 D30 以运行测试频谱。

设置测试 vd 列表后，更新 D30 和 TDF1。并绘制不同旋转锁长度的峰值强度。确定原始峰值强度降低到三分之一的旋转锁长度。

从测试运行的结果，创建最终 vd 列表用于实验。选择扫描次数，以便列表中最弱的峰值的信号与噪声比至少为 10。串联成绩单的几个反应的结果如下。

成功反应产生了20个核苷酸靶RNA。不成功的反应导致样品的不完整和失败。HPLC 对RNA样本的注射显示纯目标RNA在 38 分钟内达到峰值。

虽然更长和更短的产品与兴趣的高峰相分离。对RNA发夹的分析表明，观测到的伊米诺质子数量与二次结构模拟所期望的伊米诺质子数量相匹配。RNA芳香共振的质子碳HSQC光谱在折叠后显示四个信号。

折叠前只有三个信号。在代表获得两个不同的H8原子和两个不同的合成RNA发夹的共振曲线，G6H8体验确认交换。而A4H8没有。

对于 G6H8，选择了彩色自旋锁电源并记录了离谐振数据。在交换速度缓慢的 CG 结构中，R1rho 行值与偏移图已经显示曲线的轻微不对称，表示化学转移差速三角洲欧米茄的迹象。这在删除 R1 贡献的 R2 加 REX 情节中变得更加明显。

另一方面，GC 构建体验交换更快，R1rho 值与偏移图呈现了更广泛的曲线，即使在 R2 加 REX 图中，三角洲欧米茄的提取也变得不那么明显。一旦RNA动力学被阐明，状态可以被描述和捕获。例如，这些受困状态可以在生物测定中进行测试。

这种方法使我们能够观察活性微RNA miRNA复合物中的功能性、相关碱基配对移位、核糖体RNA的循环重新排列以及单核苷酸凸起的碱基对稳定性。