Этот протокол описывает подготовку образца РНК и установку ЯМР для измерения дисперсии релаксации протона R1rho для изучения подтверждаемого обмена в молекулах РНК. Поскольку протоны исследуются, метод не нуждается в изотопной маркировке и может напрямую обращаться к структурным особенностям, таким как смещенное спаривание оснований. Пипетка является довольно модульной в том смысле, что дисперсия релаксации R1rho может быть измерена, даже если образец получен другим методом.
Начните с подготовки образца плазмиды и создания реакции транскрипции и расщепления in vitro, как описано в текстовой рукописи. Инкубируют реакцию при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем разбавляют один микролитр образца в десятикратном загружаемом растворе.
И запустите один микролитр на денатурирующий гель PAGE. Если реакция расщепления прошла успешно, масштабируйте реакцию до нужного объема и запустите ее на ночь. Затем запустите еще один денатурирующий гель PAGE и оцените, была ли завершена реакция расщепления.
В случае неполного расщепления нагревают реакционный раствор в обычной микроволновой печи на 450 Вт в течение 15 секунд. Затем медленно охладите раствор до 37 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы повторно восхитить РНК и направляющую расщепления. И отметим образование нового осадка.
Добавьте больше неорганической пирофосфатазы и РНКазы H.Инкубируют реакцию в течение одного-трех часов при 37 градусах Цельсия. Затем подтвердите завершение реакции расщепления денатурированием PAGE. Когда реакция расщепления РНКазы Н завершена, утушить реакцию, добавив ЭДТА к конечной концентрации 50 миллимоляров.
И вихрь основательно. Процедить раствор через шприцевой фильтр длительности 0,2 мкм. И сконцентрируйте раствор в объеме, впрыскиваемом в систему ВЭЖХ для очистки.
Перед добавлением концентрированного и очищенного образца в ЯМР-трубку очистите трубку, промыв обильной водой. Затем реагент для обеззараживания РНКазы, воды и 95% этанола. После окончательного смыва водой оставьте его сохнуть.
Промойте поршень водой и используйте безворсовую салфетку для очистки реагентом обеззараживания РНКазы и 95% этанолом. После сушки трубки и плунжера добавьте 10% D2O в образец ЯМР. Используйте большой наконечник пипетки для переноса образца РНК в ЯМР-трубку, протекая его вдоль боковой части стенки трубки.
Вставьте плунжер в трубку, толкнув его вниз быстрым скручивающим движением, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем медленно потяните плунжер вверх, не создавая новых пузырьков воздуха. И зафиксируйте его парафиновой восковой пленкой. Создайте новый набор данных на основе набора данных ароматического протонного углерода HSQC, используемого на полностью меченых образцах РНК для присвоения РНК.
Задайте общие параметры и параметры, специфичные для RD. Затем установите мощность блокировки протона на 1,2 килогерца для тестирования. Создайте список тестов vd только с одной записью, ноль миллисекунд, установите TDF1 равным единице и обновите D30 для запуска тестового спектра.
После настройки тестового списка vd обновите D30 и TDF1. И построить график интенсивности пика для разных длин блокировки спина. Определите длину блокировки спина, при которой интенсивность исходного пика уменьшается до одной трети.
На итоге тестовых запусков создайте окончательный список vd для использования в эксперименте. Выберите количество сканирований таким образом, чтобы самый слабый пик списка имеет отношение сигнал/шум не менее 10. Здесь показаны результаты нескольких реакций расщепления тандемных транскриптов.
В успешной реакции была сгенерирована 20 нуклеотидная целевая РНК. Неудачные реакции привели к неполному и неудачному расщеплению образца. Инъекция ВЭЖХ образца РНК показала пик чистой целевой РНК через 38 минут.
В то время как более длинные и короткие продукты были хорошо отделены от пика интереса. Анализ шпильки РНК показал, что количество наблюдаемых протоонов имино соответствовало количеству протоонов имино, ожидаемому от моделирования вторичной структуры. Протонный углеродный спектр HSQC ароматических резонансов РНК показал четыре сигнала после сворачивания.
И только три сигнала перед складыванием. В репрезентативном на резонансных кривых, полученных для двух разных атомов H8 и двух разных синтетических шпишек РНК, G6H8 испытывает подтверждающий обмен. В то время как A4H8 этого не делает.
Для G6H8 были выбраны цветные мощности блокировки спина и записаны данные о внерезонансе. В конструкции CG, где обмен медленный, значения строки R1rho против графика смещения уже отображали небольшую асимметрию кривой, указывающую на признак разницы химических сдвигов дельта омега. Это становится еще более очевидным на графике R2 плюс REX, где вклад R1 удаляется.
С другой стороны, конструкция GC переживает более быстрый обмен, а значения R1rho против офсетного графика представляют собой более широкую кривую, где извлечение дельта-омега становится менее очевидным даже на графике R2 плюс REX. После того, как динамика РНК была выяснена, состояния могут быть охарактеризованы и пойманы в ловушку. Эти захваченные состояния могут, например, быть проверены в биологических анализах.
Этот метод позволяет наблюдать функциональные, релевантные сдвиги спаривания оснований в активном комплексе микроРНК миРНК, перегруппировки петли в рибосомальной РНК и стабильность пары оснований на одиночных нуклеотидных выпуклостях.
