Bu protokol, RNA moleküllerindeki onay değişimini incelemek için proton R1rho gevşeme dispersiyon ölçümleri için RNA numune hazırlama ve NMR kurulumunu açıklar. Protonlar yok edildiğinden, yöntem izotopik etiketlemeye ihtiyaç duymaz ve kaydırılmış baz eşleştirme gibi yapısal özelliklere doğrudan erişebilir. Pipet, numune farklı bir yöntemle üretilse bile R1rho gevşeme dağılımının ölçülebilmesi anlamında oldukça modülerdir.
Plazmid örneğini hazırlayarak ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bir in vitro transkripsiyon ve bölünme reaksiyonunu kurarak başlayın. Reaksiyonun 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatması. Daha sonra yükleme çözeltisinde numunenin bir mikroliterini on kat seyreltin.
Ve bir denatüre PAGE jel üzerinde bir mikroliter çalıştırın. Bölünme reaksiyonı başarılı olursa, reaksiyonun istenen hacme ölçeklen ve gece boyunca çalıştırın. Ardından başka bir denatüre PAGE jeli çalıştırın ve bölünme reaksiyonu tamamlanıp tamamlanmadığını değerlendirin.
Eksik bölünme durumunda, reaksiyon çözeltisini geleneksel bir mikrodalga fırında 15 saniye boyunca 450 watt'ta ısıtın. Ardından RNA'yı ve dekolte kılavuzunu yeniden elde etmek için çözeltiyi 40 dakika boyunca yavaşça 37 santigrat dereceye soğutun. Ve yeni bir çökelticinin oluşumuna dikkat edin.
Daha fazla inorganik pirofosfataz ekleyin ve RNase H.Inubate reaksiyonu 37 santigrat derecede bir ila üç saat boyunca inkübatör. Ardından dekolte reaksiyonunun tamamlandığını denatüre PAGE ile onaylayın. RNase H bölünme reaksiyonu tamamlandığında, 50 milimoler son konsantrasyona EDTA ekleyerek reaksiyonu söndürün.
Ve iyice girdap. Çözeltiyi 0,2 mikron şırınga filtresinden geçirin. Ve çözümü, saflaştırma için bir HPLC sistemine enjekte edilebilen bir hacme konsantre edin.
Konsantre ve arıtılmış numuneyi NMR tüpüne eklemeden önce bol su ile temizleyerek tüpü temizleyin. Sonra RNase dekontaminasyon reaktifi, su ve% 95 etanol. Son durulamadan sonra suyla kurumaya bırakın.
Pistonu suyla durulayın ve RNase dekontaminasyon reaktifi ve% 95 etanol ile temizlemek için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Tüpü ve pistonu kuruttuktan sonra NMR örneğine %10 D2O ekleyin. RNA örneğini NMR tüpüne aktarmak için büyük bir pipet ucu kullanın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca akıtın.
Pistonu, hava kabarcıklarını gidermek için hızlı bir büküm hareketiyle aşağı iterek tüpe yerleştirin, ardından yeni hava kabarcıkları oluşturmadan pistonu yavaşça yukarı çekin. Ve parafin balmumu filmiyle tamir et. RNA ataması için tam etiketli RNA örneklerinde kullanılan aromatik proton karbon HSQC veri kümesini temel alan yeni bir veri kümesi oluşturun.
Genel parametreleri ve RD'ye özgü parametreleri ayarlayın. Ardından proton spin kilit gücünü test için 1,2 kilohertz olarak ayarlayın. Yalnızca bir giriş, sıfır milisaniye, TDF1'i bir olarak ayarlayın ve D30'u bir test spektrumu çalıştıracak şekilde güncelleştirin.
Test vd listesi ayarladıktan sonra D30 ve TDF1'i güncelleştirin. Ve farklı dönüş kilidi uzunlukları için tepenin yoğunluğunu çizin. Orijinal tepenin yoğunluğunun üçte birine düştüğü dönüş kilidi uzunluğunu tanımlayın.
Test çalıştırmalarının sonucundan, denemede kullanılacak son vd listesini oluşturun. Listenin en zayıf zirvesinin en az 10 sinyal -gürültü oranına sahip olması için tarama sayısını seçin. Tandem transkriptlerin birkaç dekolte reaksiyonunun sonuçları burada gösterilmiştir.
Başarılı bir reaksiyonla 20 nükleotid hedef RNA üretildi. Başarısız reaksiyonlar, numunenin eksik ve başarısız bölünmesine neden oldu. RNA örneğinin HPLC enjeksiyonu, 38 dakikada saf hedef RNA için bir zirve olduğunu ortaya çıkardı.
Daha uzun ve kısa ürünler ilginin zirvesinden iyi ayrılmışken. RNA saç tokasının analizi, gözlemlenen imino protonların sayısının ikincil bir yapı simülasyonundan beklenen imino proton sayısıyla eşleştiğini gösterdi. RNA'nın aromatik rezonanslarının proton karbon HSQC spektrumu katlandıktan sonra dört sinyal gösterdi.
Ve katlamadan önce sadece üç sinyal. İki farklı H8 atom ve iki farklı sentetik RNA saç tokası için elde edilen rezonans eğrileri temsilcisinde, G6H8 onay değişimi yaşar. A4H8 olmasa da.
G6H8 için renkli döndürme kilidi güçleri seçildi ve rezonans dışı veriler kaydedildi. Değişimin yavaş olduğu CG yapısında, R1rho satır değerlerine karşı ofset grafiği zaten eğrinin hafif bir asimetrisini görüntüledi ve kimyasal kayma farkı delta omega'nın işaretini gösterdi. Bu, R1 katkısının kaldırıldığı R2 artı REX grafiğinde daha da belirgin hale gelir.
Öte yandan, GC yapısı daha hızlı değişim yaşar ve R1rho değerlerine karşı ofset arsa, delta omega'nın ekstraksiyonunun R2 artı REX grafiğinde bile daha az belirgin hale geldiği daha geniş bir eğri sundu. RNA dinamikleri aydınlatıldıktan sonra, durumlar karakterize edilebilir ve tuzağa düşürülebilir. Bu kapana kısılmış durumlar, örneğin biyolojik tahlillerde test edilebilir.
Bu yöntem, aktif bir mikroRNA miRNA kompleksinde fonksiyonel, ilgili baz eşleştirme kaymalarını, ribozomal RNA'da döngü yeniden düzenlemelerini ve tek nükleotid çıkıntılarında baz çifti stabilitesini gözlemlememizi sağlar.
