يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن الديناميكيات التوافقية للبروتين وتوصيفها، وهي ضرورية لفهم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، لا تتطلب هذه الطريقة خطوات إعداد عينات متخصصة وتوفر توصيفا شاملا للحراك والديناميكا الحرارية والجوانب الهيكلية للتوازن التأكيدي. CPMG التشتت الاسترخاء يمكن تطبيقها على نطاق أوسع لتوصيف ديناميات تأكيدية في الأحماض النووية والجزيئات الحيوية الأخرى، وكذلك لتوصيف التفاعلات الجسيمات النانوية ليغاند.
يستهدف بروتوكولنا مستخدمي CPMG لأول مرة. لذلك فهي نقطة انطلاق جيدة. ومع ذلك، نتوقع من المستخدمين معرفة الخطوات الأساسية لتشغيل تجارب NMR التقليدية.
لإعداد تجربة NMR لأول مرة، قم بتنزيل هذه الملفات التكميلية وفك ضغطها أولا. نسخ البتات. vv و trosy_15N_CPMG.
vv الملفات في مجلد برنامج نبض لدليل برنامج نبض. افتح برنامج الاستحواذ واستخدم أمر EDC لنسخ تجربة النيتروجين الهيدروجيني 15 HSQC التي تم تشغيلها سابقا إلى تجربة جديدة. استخدم الأمر برنامج النبض لتحميل trosy_15N_CPMG.
ملف برنامج نبض vv في التجربة التي تم إنشاؤها حديثا. ثم استخدم الإرشادات من نهاية ملف برنامج النبض لإعداد تجربة CPMG. لإعداد تجربة NMR روتينية، أدخل العينة إلى المغناطيس وتنفيذ جميع خطوات اكتساب NMR الأساسية.
تعيين P1 لمدة الهيدروجين الثابت 90 درجة البقول وP7 لمدة النيتروجين 15 الثابت 90 درجة البقول. في نافذة الاستحواذ، قم بتعيين عرض الوسط والعرض الطيفي لأبعاد الهيدروجين والنيتروجين 15. تعيين تأخير الاسترخاء إلى T2 0.7 واستخدام الأمر قائمة VC لإنشاء قائمة أرقام عدد صحيح المقابلة N.After التأكد من أن كل إدخال في القائمة يتوافق مع حقل CPMG مختلفة وفقا لCPMG قدم يساوي 4N مقسوما على D30، تحقق من أن الرقم الأول في القائمة هو صفر.
تعيين L8 إلى عدد الإدخالات في قائمة VC، L3 إلى عدد من النقاط الحقيقية للبعد غير المباشر، و 1TD إلى L8 مرات L3 مرتين. لتحسين قمع المياه، تعيين كسب المتلقي إلى واحد واكتب سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 91 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.
باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB0 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال منقوطة عند السطر 91 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. لتحسين SPDB11، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وسحب EDC نوع لفتح ملف برنامج نبض.
على السطر 168 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB11 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة عند السطر 168 واحفظ الملف.
لتحسين SPDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 179 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB2 لتقليل كثافة إشارة FID.
عند تعديل كثافة الإشارة، إعادة إدخال منقوطة في السطر 179 من ملف برنامج النبض وحفظ الملف. لتحسين PLDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 184 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.
باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات PLDB2 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة في السطر 184 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. تشغيل الأمر RGA لتحسين كسب المتلقي.
ثم قم بتشغيل الأمر ZG لبدء التجربة. في هذا الرقم، يمكن ملاحظة نتائج ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة لكل ذروة في طيف النيتروجين الهيدروجيني 15 Trosy. من ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة ، من الممكن تقدير مساهمة التبادل في الاسترخاء العرضي النيتروجين 15 لكل مجموعة AMI العمود الفقري.
من خلال التخطيط للاسترخاء العرضي على البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين قيد التحقيق ، من الممكن تحديد المناطق الهيكلية التي تخضع لتبادل تأكيدي على مقياس الوقت مللي ثانية ميكروثانية. إرجاع النمذجة من منحنيات التشتت الاسترخاء باستخدام المعادلات كارفر ريتشاردز المعلمات الحرارية والحركية على عملية التبادل، مثل السكان كسور من الدول في التوازن ومعدل التبادل بين هذه الدول. ويمكن بعد ذلك أن يكون الاعتماد على درجة الحرارة من هذه المعلمات الحرارية والحركية على غرار باستخدام المعادلات فانت هوف وحلقة I، على التوالي، للحصول على معلومات مفصلة عن حيوية تبادل تأكيدي.
ومن الأهمية بمكان تحسين جميع معايير الاستحواذ بعناية، ولا سيما P7. ومن المهم أيضا إنتاج عينات نقية ومتجانسة للغاية لتجنب التشتت الزائف. ويمكن استخدام معلمات الرقائق الحركية والديناميكية الحرارية والكيميائية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول لاستخلاص معلومات نشطة وهيكلية عن الأنواع التي تخضع للتبادل التأكيدي. توصيف ديناميات تأكيد البروتين التي تم الحصول عليها من قبل أساليب CPMG يوفر معلومات حاسمة نحو فهم الإشارات والنشاط الأنزيمي، فضلا عن وجهات نظر جديدة لتصميم المخدرات.
