كعنصر معدني مهم، يلعب الكالسيوم دورا رئيسيا في نمو ومراقبة جودة الفواكه الشجرية مثل التفاح، فإنه يمكن تنظيم صلابة، محتوى السكر، فترة التخزين، واضطراب الفسيولوجية أثناء التخزين. تصوير الكالسيوم هو الطريقة الأكثر غربية للكشف عن التغيرات الديناميكية في أيونات الكالسيوم في السيتوبلازم. مؤشرات الفلورسنت جزيء صغير، مثل فلوو-4/AM لديها انتقائية أيون الكالسيوم محددة ويمكن تحميلها بشكل غير باضع من قبل حضانة استيفيريشن، وهو مرن وسريع وغير سام للخلايا.
هذا البروتوكول سوف يقدم طريقة لتحميل جزيء صغير الكيميائية الفلورسنت كاشف فلوو-4/AM في البروتوبلاست النباتية. استخراج Protoplast إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الانزيم في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. اختيار تفاحة صحية وناضجة، ثم شريحة اللب إلى 10 مرات 5 مرات 1 حجم ملليلتر مكعب.
ضع قطع اللب في محلول أنزيمي، ثم أغلق الأنبوب. حضانة أنبوب في 28 درجة لمدة ساعة واحدة. مكبل في 70 دورة في الدقيقة في الظلام.
بعد ذلك، غسل قطع اللب، يستنشق كل حل الأنزيمية ومن ثم إضافة 0.5 ملليلتر الحل الأساسي. جهاز طرد مركزي بسرعة 300 غرام لمدة دقيقتين. يمكن الحصول على تعليق Protoplasts عن طريق استهزاء الحل السفلي.
جزيء صغير الكيميائية الفلورسينس تلطيخ. قم بإعداد محلول التحميل fluo-4/AM مع 2 ميليمولار فلوو-4/AM، و20٪ethyl127، والمحلول الملحي العازل بالفوسفات 10X بنسبة واحد إلى واحد إلى اثنين. إضافة 1 ميكرولتر تحميل حل فلوو-4/AM إلى 99 ميكرولتر تعليق بروتوبلاست.
التركيز النهائي للأصباغ الفلورية هو 5 ميكرومولار. خلط الحل ثم إغلاق الأنبوب. في الوقت نفسه، الحديد lanthanum الكالسيوم أو تفرد عامل الفلورسنت الكيميائية الجزيئية الصغيرة.
إضافة ميكرولتر واحد أو 10 ميكرولتر أكثر من الحديد lanthanum ومن ثم حل تحميل ميكروليتر واحد من فلوو-4/AM إلى 98 ميكروليتر تعليق بروتوبلاستس. التركيز النهائي للحديد اللانثانوم هو 100 ميكرومولار. خلط الحل ثم إغلاق الأنبوب.
احتضان في 37 درجة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد ذلك، الطرد المركزي بسرعة 300 غرام لمدة دقيقتين. أسبيرات إلى 17 ميكرولتر الحل وإضافة 17 ميكرولتر الحل الأساسي.
احتضان تعليق protoplast في 37 درجة لمدة 30 دقيقة إلى تماما بعد ذلك، يستنشق 50 ميكرولتر تعليق بروتوبلاستس والتنقيط على شريحة. مراقبة تحت المجهر الفلوري. حدد 20x التكبير وقناة GFP لمراقبة.
ضبط السطوع بشكل موحد إلى 0.5. خطوة حاسمة في هذه الطريقة المقترحة هي غسل البقعة في المنصات الأولية واحتضانها لمدة 30 دقيقة. الغسيل غير كافية يسبب الداعم المفرط على الفلورسينس أثناء المراقبة والحضانة يسمح لتحميل أفضل أو التحقيق في السيتوبلازم.
Protoplasts البقاء المقايسة اتخاذ 99 ميكروليتر تعليق protoplasts بعد احتضان في 37 درجة لمدة 30 دقيقة. إضافة 1 مل في حل FD لتعليق بروتوبلاستس. خلط الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات ومن ثم إغلاق الأنبوب.
البقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في الظلام. إعداد الشرائح ومراقبتها على المجهر الفلوري مع قناة GFP. نقدم لكم النتائج التالية الشكل الأول.
نحن نستخدم طريقة الأنزيمية جميع الحصول على protoplasts من اللب. وكان بعض protoplasts vacuole في حين أن البعض الآخر لا. كانت ملطخة protoplasts مع FD لمدة خمس دقائق وتظهر فلوريسي في السيتوبلازم مما يدل على أن ارتفاع درجة الحرارة، 37 درجة لا يؤثر على الجدوى أو protoplasts الشكل الثاني.
لم تظهر البروتوبلاست أي مضان في أحد مؤشرات مضان الكالسيوم أو أنها لم يتم تحميلها فيها. مما كانت عليه في فلوو-4/AM تم تحميلها في protoplast، وcytoplast، ولكن ليس vacuole أصبحت الفلورسنت. تمت إضافة الحديد Lanthanum التي تمنع قنوات الكالسيوم بشكل فعال غشاء الخلية إلى تحميل بروتوبلاست فلوو-4/AM.
في التركيز النهائي من 100 اللانثانوم ميكرومولار يقلل بشكل كبير من كثافة مضان الكالسيوم. وأظهرت هذه النتائج كذلك أن فلوو-4/AM البقاء بشكل فعال في الكالسيوم في السيتوبلاست وأنها تظهر تغييرات ديناميكية في محتوى الكالسيوم. الشكل الثالث تم تحليل نتائج fluo-4/AM باستخدام IMH المعتمدة بالإضافة إلى 6.0 برنامج fluo-4/AM تلطيخ مع إضافة الحديد lanthanum خفضت بشكل كبير قيمة فلوريسسينس من الكالسيوم السيتوبلازمية.
في هذا الفيديو، تم الحصول على جميع protoplasts عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لقد نجحنا في تحميل المسابير الفلورية في بروتوبلاست عند 37 درجة. أكثر من ذلك ، لم تؤثر الطريقة على صلاحية البروتوبلاست.
وباختصار، فإن الطريقة الموصوفة هنا مفصلة العينية. التغيرات الديناميكية في أيونات الكالسيوم السيتوبلازمية في خلايا لب التفاح وبالتالي توفير 10 يدعم على قدم المساواة لغرض آخر من الدراسات المتعلقة بالكالسيوم.
