ويتم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست ، ومجلس البحوث الطبية ، والجمعية الملكية ، وبرمنغهام سيتي والعلوم والبحوث الاستئماني العقم. نود أن نعترف مساعدة الخبراء للبحوث العلامة في بناء وتكامل وحدات التصوير.

الحيوانات المنوية من الذكور الخصبة صحية ، مع تحليل السائل المنوي الطبيعي ، وتعد عادة في التصوير على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخزين عينات السائل المنوي عند 37 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 30 دقيقة. يتم عزل الخلايا من البلازما المنوية التي تسبح يصل الى استكمال ايرل محلول الملح المتوازن (sEBSS ؛ ملي : 1.8 CaCl 2 0.2 H 2 O ، 5.37 بوكل ، 0.81 MgSO 4 0.7 H 2 O ، 26.2 NaHCO 3 ، 1،0 ناه 2 ص 4. 2H 2 O ، كلوريد الصوديوم 116.4 ، 55.6 D - غلوكوز ، 2.73 البيروفات نا ، نا 41.8 اكتات) تستكمل مع 0.3 ٪ حامض الفحم de-lipidated/fatty مجانا BSA الخامس الكسر (BSA نوعية أمر حاسم لتمكين الطاقات ناجحة من الحيوانات المنوية). هو pipetted 1 مل من sEBBS في كل من سلسلة من الأنابيب 5 مل وunderlayered بلطف مع 0.3 مل من السائل المنوي. بعد حضانة لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2) تتم إزالة بلطف الأعلى 0.7 مل من كل أنبوب والمجمعة. غير المخفف 10 ميكرولتر لتعليق الحيوانات المنوية بنسبة 90 ميكروليتر من 1 ٪ (V / V) الفورمالين لشل حركة الخلايا ، ثم يتم عد الحيوانات المنوية في غرفة نويباور. ثم يتم ضبط كثافة خلية في تعليق (مع sEBSS) إلى 6 ملايين خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تقسيم العينة إلى aliquots من 200 ميكرولتر في أنابيب فضفاضة وتوج وحضنت (37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2). لمدة 5-6 في ساعة للسماح تمكين الطاقات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سبق Coverslips (22x50 ملم) تعامل مع بولي يسين - D. يتم تطبيق ميكرولتر من 10 بولي - D - يسين حل (10 ٪ ث / ت) وعدد من قطرات صغيرة لمركز ساترة. وسمح للبولي - D - يسين في الهواء الجاف. هذا يمكن أن يكون في مرحلة ساخنة وينبغي لاستكمال جفاف. ومرفق مع الشحوم فراغ ساترة لالمغلقة ، بنيت لهذا الغرض ، perfusable ، وغرفة التصوير البولي (أبعاد 35 × 20 مم × 5 ملم ، والقدرة ≈ 180 ميكرولتر). مماثلة لغرفة RC20 وارنر وبولي - D - يسين ساترة المغلفة يشكل قاعدة للغرفة عندما يتم النظر إلى الخلايا على مجهر مقلوب ويبلغ قطرها 12 ملم دائرية ساترة أشكال السطح العلوي للغرفة ، مما يسمح للانتقال الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم ولاية أوريغون الخضراء BAPTA1 - AM (OGB) أو الأخضر 1 - AM الكالسيوم لخلايا وضع العلامات. مستعدة OGB عن طريق إذابة في DMSO. يتم تضمين Pluronic حمض F127 (أ المنظفات) في DMSO لمنع &quot;تكتل&quot; للصباغة. ويمكن إعداد هذا في المختبر (100 ملغ في Pluronic DMSO مل 0.5) ، وذلك مباشرة قبل استخدامها ، أو يمكن شراؤها معدة سلفا. يضاف إلى 20 ميكرولتر قسامة 50 ميكروغرام من OGB (2.5 ملغ / مل). ثم يمكن أن يتم تخزين القارورة المجمدة وإذابة لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تمكين الطاقات من الحيوانات المنوية (5-6 ساعة في sEBBS و 37 درجة مئوية ، 6 ٪ CO 2) يضاف يتم تحديد أنبوب للتصوير و 1.2 ميكرولتر من محلول OGB ، مع إعطاء تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. ومن ثم حضنت الأنبوب عن 40 دقيقة أخرى ، وبعد ذلك يتم حقن الخلايا برفق تعليق بمنفذ تدفق غرفة التصوير مع طرف P1000 ماصة (الأزرق). وضعت الغرفة في الجانب ساترة الحاضنة ، وبولي - D - يسين المغلفة أسفل ، لمدة 20 دقيقة. الخلايا تميل إلى السباحة على طول سطح الغرفة ، وسوف تنضم إلى منطقة بولي - D - يسين المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن هي التي شنت الغرفة على المجهر ، متصلا جهاز نضح في وperfused دقيقة تقريبا 0.5 مل /. مضخة الأسطوانة يغذي إزالة الملوحة في الغرفة والفائض من ميناء الخروج عن طريق مضخة الشفط مع الفخ. ترك الإعداد في الظلام لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في حين يتم إزالة الخلايا فضفاضة وصبغ خارج الخلية التي نضح للغرفة. استقرار درجة الحرارة في غاية الأهمية لأن التقلبات الصغيرة قد لا يؤثر فقط على الخلايا كا 2 + التوازن ، ولكنه قد يؤثر أيضا K د للصباغة. وتجرى التجارب عادة عند 25 درجة مئوية ، حقق من خلال الحفاظ على درجة حرارة غرفة مظلمة على هذا المستوى. لقد وجدنا أن الحفاظ على درجة حرارة الغرفة على المستوى المطلوب توفر قدرا أكبر من الاستقرار في درجة الحرارة والتركيز من استخدام مرحلة لدرجة الحرارة للرقابة أو سخان حراريا تسيطر على تدفق المياه المالحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينظر إلى الخلايا تحت النقيض من المرحلة (60x 40x او النفط الغمر) يتم تحديد الهدف ، ومنطقة للتصوير. ويفضل ذلك الجزء من منطقة بولي - D - يسين المغلفة التي تقع بالقرب من مدخل الميناء ، حيث تدفق المياه المالحة هو الصفحي ومتسقة. من المهم أيضا لاستخدام المنطقة حيث كثافة الخلية المناسب (الكثافة المفرطة يؤثر على نوعية وسلامة البيانات من خلال التقاط الإشارات من الخلايا المجاورة) ، وحيث الخلايا هي التي تعلق على نحو كاف ولكن النشاط سوطي غير واضحة. يتم حفظ صورة النقيض من المرحلة. ثم يتم تبديل إلى وضع المجهر مضان (480 نانومتر الإثارة ؛ انبعاث 540 نانومتر) ، ويتم تخفيض وقت التعرض إلى الحد الأدنى المطلوب للحصول على صورة واضحة مضان (عادة 5-20 مللي ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبدأت التجربة من خلال تفعيل الحصول على الصور وقتا سلسلة البرامج (IQ). عادة ما يتم الحصول على الصور عند 0.1 هرتز ويقتصر الإضاءة على فترات من الحصول على الصور فقط باستخدام softwaإعادة المغلاق للرقابة. ويمكن استخدام قدر أكبر من معدلات الحصول على الصور ولكن يجب أن يكون بدل لمشاكل تبييض وجيل من التحف بسبب ضرر الصورة إلى الخلايا (انظر المناقشة). والذكاء (ومعظم البرامج الأخرى اقتناء منصات) تسمح في الوقت الحقيقي الرسوم البيانية من خلال التجربة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة مراقبة التلاعب مدة 3-5 دقائق من مكونات المياه المالحة (مثل [كا 2 +] س) وتطبيق الأدوية ويتحقق عن طريق استبدال المالحة في رأس الارواء. ويلاحظ بالإضافة إلى ذلك الوقت من كل الحوافز بحيث يمكن احتساب ذلك الوقت من وصوله الى غرفة التصوير ، وتوفير الدقة الكافية لتقييم ردود الفعل البطيئة وصفها هنا (عينات عند 0.1 هرتز). ويمكن للاستجابات أسرع يتحقق قدر أكبر من الدقة عن طريق إضافة مؤثرات مباشرة إلى تدفق المياه المالحة من خلال منفذ تدفق الثانية على النحو الوارد في غرفة RC20 وارنر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل الصور الرمزية باستخدام الذكاء. يتم رسم مناطق الفائدة (رويس) جولة كل خلية (أو جزء من الخلية) ، وكذلك تم تحديد منطقة حرة خلية (على خلفية الطرح التلقائي من قبل البرنامج. ثم يتم التحقق من هذه السلسلة الصورة لإزالة الخلايا التي ماتت أو خضع لتفاعل الجسيم الطرفي ( الذي يظهر على شكل زيادة كبيرة وسريعة في مضان يليه فقدان صبغة هيولي) خلال التجربة وتلك التي أظهرت حركة كافية للتسبب التحف عند تحليلها على شكل سلسلة الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم الحصول على سلسلة زمنية كثافة مضان لكل عائد الاستثمار ويتم تحليل هذه البيانات حاليا في Excel. في البداية هو تطبيع مضان إلى القيمة يعني الحصول عليها خلال فترة الرقابة ، وذلك باستخدام المعادلة R = [(FF بقية) / F بقية] × 100 ٪ ، حيث R هي نسبة التغير في مضان مقارنة بالفترة السيطرة ، و F هو شدة الإسفار في الوقت t وبقية F هو يعني ما لا يقل عن 30 من قرارات F تم الحصول عليها خلال فترة مراقبة. </li></ol> ممثل النتائج الشكل 1 يبين سلسلة من الصور من التجربة التي كانت في حفز الخلايا مع هرمون البروجسترون ميكرومتر 3. الصف العلوي والفيلم عرض الصور 1 مضان النطاق في الرمادي ، وهي واردة في نفس السحراء أدناه (في الفيلم و2) في pseudocolor (بحث &#39;16_colorsالجدول&#39; J في الصورة) ، حيث &quot;بارد&quot; الألوان تشير كثافة منخفضة والفلورسنت &#39;الحارة&#39; تشير إلى كثافة مضان الألوان عالية. يمكن الاطلاع على الخلايا في pseudocolor خلال التجربة ، وذلك باستخدام جداول البحث في معدل الذكاء ، ولكن باستخدام مقياس الرمادية عموما أكثر إفادة لتقييم فيما إذا كانت الخلايا التي تحمل علامات جيدة. وقد جمعت أول صورتين في 0 ق ق 100 ، وبعد بدء التسجيل. وينبغي أن تكون مستقرة ومضان يميل إلى أن يكون الأقوى في منطقة الرقبة وجسيم آخر الحيوانات المنوية. دخلت غرفة التصوير البروجستيرون في حوالي 175 ق والثالث 3 والرابع 4 لوحات (180 ق ق و 220) تظهر الزيادة السريعة في [كا 2 +] ط (مضان) الصادرة في الرأس ومنطقة الرقبة الخلفي للخلية. الصور اللاحقة في 290 ، 360 ، 740 ، 990 و s 1440 ، تبين اضمحلال الأولي [كا 2 +] ط عابرة والتنمية من ارتفاع متواصل الثانوية. الشكل 2 يبين تحليل البيانات ، وتحويل القيم مضان الخام لكل عائد إلى تطبيع مضان (نسبة التغير في مضان مقارنة بالفترة التحكم) ويبين الشكل 3 الوقت تطبيع المؤامرات مضان لمدة 3 خلايا تظهر &quot;نموذجي&quot; الاستجابة لهرمون البروجسترون ميكرومتر 3. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مثال البيانات من خلية وحفز مع البروجسترون. وتظهر سلسلة من الصور مضان في مقياس الرمادية (الصف العلوي) ، وpseudocolor (الصف السفلي). النقاط الزمنية هي 0 ، 180 ، 220 ، 290 ، 360 و 990s. دخلت 3 ميكرومتر البروجسترون غرفة التصوير في 175 ثانية. وتظهر في لوحة رويس الأولى. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تحليل البيانات وحيدة الخلية في Excel مضان. ترتيب الأرقام في الأسود وسلسلة زمنية من البيانات مضان ، عموديا. الأرقام الواردة في الحمراء (أدناه) هي البيانات التي تم الحصول عليها تطبيع باستخدام المعادلة الواردة في النص. يبين الرسم البياني تطبيع مضان وقت مؤامرة لمدة 64 خلية في هذه التجربة التي ، بناء على التحفيز ، ويظهر ارتفاع عابر في مضان يليه ارتفاع بطيء وسلسلة من التذبذبات الصغيرة. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الإسفار وقت آثار لمدة 3 الخلايا الفردية ، كما أعربت نسبة التغير فيما يتعلق بمكافحة القيمة.. تم ادراج 3 ميكرومتر البروجستيرون في ذلك الوقت والتي تمثلت في السهم. يظهر خط متقطع يعني مضان السيطرة.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عندما نفذت بنجاح ، وهذا الأسلوب يسمح بتسجيل توزيع وحركية والعفوية التي يسببها الاشارات + كا 2 في الحيوانات المنوية البشرية. ويمكن الحصول على ردود من عدد كبير من الخلايا (حتى 200) وهو أمر مهم لأن الحيوانات المنوية البشرية يمكن أن تظهر الكثير من التباين في إشاراتها العفوية وحفز + كا 2. العلامات الناجحة وبقاء خلايا أثناء التسجيل تعتمد اعتمادا كبيرا على نوعية العينة. عينات الفقراء تعطي العلامات الفقراء ، والاستجابات الفقراء والخلايا قد يموت أثناء التسجيل. الحيوانات المنوية البشرية حساسة جدا للضرر الصورة ونحن بالتالي استخدام الحد الأدنى من الإضاءة اللازمة (حيث شدتها وزمن التعرض) من أجل تعظيم بقاء الخلية وتقليل الآثار بسبب وفاة الخلية. كاميرا عالية الحساسية (السماح باستخدام الإضاءة المنخفضة الحدة) هو مكسب كبير منذ سوف تلتقط الكاميرا مضان ضعيفة. الخلفية المضاءة ، EM - CCD الكاميرات بشكل خاص مناسبة تماما ، وإن كان مكلفا للغاية. إنارة LED (بدلا من استخدام الزئبق مصباح زينون أو مع مرشح الإثارة يحسن أيضا بقاء الخلية (Nishigaki وآخرون ، 2006). نحن لا نستخدم Fura - 2 ، على الرغم من مزايا واضحة لنسبة متري ، والتصوير ، ولأن Fura يتطلب إثارة للأشعة فوق البنفسجية ، ولأنه من الضروري اتخاذ صورتين لكل نسبة. بالنسبة للبيانات التي تم الحصول عليها مع طول موجي واحد ، والأصباغ الضوء المرئي ، وتطبيع كثافة مضان يعوض إلى حد كبير عن الفرق في تحميل صبغ بين الخلايا ، ولكن ليس للتوزيع الصبغة داخل خلية واحدة ، ويجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار. وإن كان يمكن ، والأصباغ الطول الموجي واحد من حيث المبدأ ، يجب معايرة ، ودقة الأسلوب ونحن الفقراء لا تحاول القيام بذلك. في حين أن البيانات التي تم الحصول عليها مع نسبة Fura - 2 (أو انبعاث نسبة الصبغة الهندية) ، حتى من دون المعايرة ، وإعطاء تمثيل المؤمنين مقبول من التغيرات النسبية في [كا 2 +] ط ، كثافة مضان من الأصباغ طول موجي واحد بعيد عن خطي المتصلة [كا 2 +] ط على الجزء الأكثر فائدة من منحنى العلاقة لتشبع الأصباغ طول موجي واحد يقترب عادة لوغاريتمي. نستخدم حاليا أوريغون الخضراء BAPTA - 1 (الشكل 4) لأنها حساسة للتغيرات صغيرة في [كا 2 +] ط قريبة من مستوى الراحة ليالي (50-100 نانومتر). عندما [كا 2 +] يرتفع فوق ط 1 ميكرومتر الردود ستكون ممثلة تمثيلا ناقصا من حيث التغير مضان وصبغ قد تشبع. خيار لتحسين هذه التقنية دون اللجوء إلى الإثارة الأشعة فوق البنفسجية هو مضاعفة الخلايا مع صبغة تحميل مثل Fluo - 3 و الحمراء Fura. يمكن متحمس سواء في 488 نانومتر ولكن في نفس الوقت من ردود مختلفة جدا. تسجيل الانبعاثات في 540 و 650 نانومتر يوفر النسبة التي يمكن أن توفر أفضل طريقة لمراقبة دقيقة من [كا 2 +] ط (Haughland ، 2002) ويمكن أن تنطبق على الحيوانات المنوية (Nisigaki وآخرون ، 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. العلاقة بين حرة [كا 2 +] (نانومتر) وانبعاث مضان في ذروة الموجة (حوالي 525 نانومتر) لجرين ولاية أوريغون BAPTA - 1 وأوريغون الخضراء BAPTA - 2. OGB1 يعطي أعلى مضان يستريح في [كا 2 +] ولكن التشبع في المستويات الأدنى ، وبالتالي لديه مجموعة صغيرة صالحة للاستخدام. تم الحصول على بيانات عن هذه المؤامرات من كتيب المسابر الجزيئية (Haughland ، 2002).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

مضان المجهري للخلايا محملة الفلورسنت ، كاليفورنيا<sup&gt; 2 +</supيستخدم&gt; الأصباغ حساسة لقياس الجوانب المكانية والزمانية للكا<sup&gt; 2 +</sup&gt; الإشارات في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة في مختبراتنا لتحميل تعليق الحيوانات المنوية البشرية مع CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; الإبلاغ عن الأصباغ وقياس إشارة مضان خلال التحفيز الفسيولوجية. يتم عزل الخلايا متحركة بنسبة تصل السباحة مباشرة والمحتضنة في ظل ظروف لتقوية قدرات 0-24 ساعة ، وهذا يتوقف على التجربة. الخلوي نفيذ AM النموذج استر (acetoxy الميثيل استر) من كاليفورنيا<sup&gt; 2 +</supثم يضاف&gt; الإبلاغ عن صبغ لقسامة الخلية وفترة من 1 ح يسمح للتحميل من صبغة في السيتوبلازم. نستخدم الأصباغ مرئية الطول الموجي للتقليل من الصور الأضرار التي لحقت الخلايا ، ولكن هذا يعني أن تسجيل ratiometric غير ممكن. وتناقش مزايا وعيوب هذا النهج. خلال فترة التحميل الخلايا يتم تقديمها الى غرفة التصوير ، وسمح للانضمام إلى ساترة بولي - D - يسين المغلفة. في نهاية الفترة الصبغة الفائضة التحميل وفضفاضة تتم إزالة الخلايا عن طريق الاتصال من الغرفة إلى جهاز نضح. هو perfused الغرفة باستمرار ، ثم تضاف محفزات وملاحات المعدلة إلى رأس الارواء. التجارب التي تسجل مرور الزمن اقتناء الصور وتحليلها في مضان حاليا من التفصيل ، عن طريق رسم يدويا مناطق الفائدة. تم تطبيع البيانات إلى ما قبل مستويات التحفيز مثل ذلك ، كل خلية (أو جزء من خلية) ، رسم بياني يبين كاليفورنيا<sup&gt; 2 +</supيتم الحصول على&gt; ردا على نسبة التغير في مضان.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm at JoVE.com

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

التحفيز أثار [CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; يتم تقييم] ط اشارات الحيوانات المنوية الإنسان الفردية. يتم تحميل خلايا متحركة مع CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; حساسة صبغة الفلورسنت (AM - استر الأسلوب) وثبتوا في غرفة perfusable. يتم تصوير الخلايا الوقت الفاصل بين المجهري مضان وحفزت عبر المتوسط ​​perfusing. ويتم تحليل استجابات الخلايا واحد (أو مناطق) حاليا باستخدام اكسل.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K Views.  University of Birmingham. التحفيز أثار [CA 2 + يتم تقييم] ط اشارات الحيوانات المنوية الإنسان الفردية. يتم تحميل خلايا متحركة مع CA 2 + حساسة صبغة الفلورسنت (AM - استر الأسلوب) وثبتوا في غرفة perfusable. يتم تصوير الخلايا الوقت الفاصل بين المجهري مضان وحفزت عبر المتوسط ​​perfusing. ويتم ...

Video: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

الكالسيوم في الجسم الحي 2 + -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup&gt; 2 +</sup&gt; العابرون والتيارات غشاء

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

تقنيات التصوير طليعة الطور والطورية من الانقسام الاختزالي الأول في مجال الاتصالات الأرضية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...