This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

نقدم إجراءات تفصيلية لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في العصبية البشري خلايا SH-SY5Y. ويمكن تكييف هذه الإجراءات لصورة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ إشارات في العديد من أنواع الخلايا 8-10. 1. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا ليتم تصويرها وفقا لتعليمات المدرجة على المورد الخاصة بهم على شبكة الإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بضعة أيام قبل التصوير، وخلايا الحصاد نمت في قارورة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA (2-3 دقيقة). وبعد انفصال، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام ثقافة لإبطال نشاط التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور الخلايا في أطباق التصوير أسفل الزجاج في كثافة 3-7 × 10 4 خلايا في طبق. حدد الخلايا للتجارب التصوير عندما تصل إلى 60٪ التقاء (2-3 أيام). </li></ol> 2. إعداد حلول والكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكالسيوم 2+ المحتوية HEPES مخزنةمحلول الملح (كاليفورنيا 2+ -HBSS) تتكون من (مم): 135 كلوريد الصوديوم، و 5.4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 10 HEPES، و 10 الجلوكوز. الرقم الهيدروجيني = 7.4 في درجة حرارة الغرفة (RT) مع هيدروكسيد الصوديوم. إعداد الكالسيوم 2+ -HBSS بدون إضافة السكر وتخزينها في 4 ° C. إضافة الجلوكوز في حل مباشرة قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان أشكال غشاء نفيذ من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520 (1 ملم)، CI-IP 3 (200 ميكرومتر)، وEGTA (100 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) تحتوي على 20٪ pluronic F-127. قسامة هذه الكواشف في أنابيب إيبندورف وتخزينها، ومحمية من الرطوبة والضوء، في -20 ° C. </li></ol> 3. تحميل الخلايا مع غشاء نفيذ كال-520، CI-IP 3 و EGTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;العازلة تحميل&quot; عن طريق تمييع الحلول الأسهم من غشاء نفيذ كال-520 و CI-IP 3 إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر، على التوالي، في كا 2+ -HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مكعبوسائل الإعلام lture وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكالسيوم 2+ -HBSS واحتضان الخلايا في العازلة تحميل لمدة 60 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة تحميل وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، في هذه الخطوة، خلايا الحمل مع EGTA / AM عن طريق تمييع الحل الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في كا 2+ -HBSS ثم احتضان الخلايا لمدة 30-60 دقيقة في RT في الظلام. وبعد هذه الحضانة، وشطف خلايا ثلاث مرات مع الكالسيوم 2+ -HBSS قبل الانتقال إلى الخطوة 3.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا في كا 2+ -HBSS لمدة 30 دقيقة للسماح دي الأسترة من الكواشف المحملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل التصوير، ويحل محل الكالسيوم 2+ -HBSS مع &quot;جديدة&quot; كا 2+ -HBSS من أجل إزالة أي صبغة يمكن أن تكون قد تسربت إلى الحمام أثناء الحضانة النهائية. </li></ol> 4. الكالسيوم 2+ </sup&gt; الحصول على صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على الهدف 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب صحن التصوير على مسرح المجهر المقلوب وجعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء المرسل. من المهم لتأمين طبق التصوير لمنع الحركة أثناء التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيء الخلايا مع ليزر 488 نانومتر من أجل إثارة كال-520 وجمع مضان المنبعثة (λ&gt; 510 نانومتر) باستخدام كاميرا EMCCD عالية السرعة. ملاحظة: حزمة البرامج التي تعمل المجهر تسمح للمستخدم لترجمة عدسة التركيز السماح شعاع الليزر ليتم إدخال إما على حافة القصوى من الفتحة الخلفية الموضوعية (لTIRF الإثارة) أو أكثر مركزيا (ل&quot;WF&quot; الإثارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج EMCCD، والحد من مجال التصوير من كامل 512 × 512 بكسل من أجل جمع البيانات على قرار الزمني اللازم لالتقاط المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث. ملاحظة: على سبيل المثال، رباعية مركزيةالحصول على 256 × 256 بكسل بسرعة تصل نسبة الاستحواذ إلى 66 إطارا في الثانية. ومن الممكن أيضا لزيادة معدل الإطار الكاميرا EMCCD إلى 500 إطارا في الثانية باستخدام وظيفة وضع المحاصيل المعزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين برنامج لتسجيل تلقائيا بضع ثوان من النشاط الأساسي، وتقديم ومضة الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا وتستمر لمدة 10-30 ثانية تسجيل آخر. ملاحظة: يتم تسليم وميض الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصدر ضوء قوس زينون قدم من خلال الأشعة فوق البنفسجية تعكس مرآة مزدوج اللون في ميناء الخلفي للالمجهر. يتم تعديل مدة وشدة فلاش للأشعة فوق البنفسجية تجريبيا لاستحضار تردد المطلوب من الكالسيوم المحلية 2+ الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الملفات كما مداخن صورة للتحليل خارج الخط. </li></ol> 5. الكالسيوم الآلي تحليل 2+ صورة ملاحظة: من الممكن لعرض ومعالجة وتحليل البيانات التي تم التقاطها باستخدام العديد من حزم البرامج التجارية. ومع ذلك، وضعنا خوارزمية لأتمتة بسرعة لتحديدتحليل د المحلية من الكالسيوم 2+ الإشارات. وصف مفصل للمرشحات المكانية والزمنية المستخدمة في هذه الخوارزمية، جيل من ΔF / F 0 وتحديد / تحليل الروتينية يمكن العثور عليها في 11. وقد تم تطوير هذه الخوارزمية لتشغيل على المصدر المفتوح منصة برمجيات بيثون، ويمكن الحصول عليها، جنبا إلى جنب مع البيانات التجريبية عينة وإرشادات تفصيلية المستخدم، من قبل المؤلف المقابل بالبريد الإلكتروني (ismith@uci.edu). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملفات المراد استيرادها إلى خوارزمية مكتوبة مخصصة لتنسيق الملف ومتعددة طائرة .tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد موقع المجلد الذي يحتوي على خوارزمية تحليل وانقر نقرا مزدوجا فوق run.exe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الملف .tiff لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المعلمات التحليل في مربع الحوار المفتوح. انظر الشكل 2A للالمعلمات الافتراضية للبيانات العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مستوى الأسود على أن يعوض من الصورة كومة إما عن طريق تحريك المؤشر إلى جزء من مجال الرؤية التي لا نبعد التمديد تحتوي على الخلية (انظر الشكل 2B) أو عن طريق الدخول على مستوى الأسود باستخدام &#39;تعيين مستوى الأسود&#39; موجه يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة أربع نوافذ على الشاشة التالية تحليل من قبل البرنامج (الشكل 2C-F). C هي صورة أحادية اللون من يستريح مضان من الخلايا التي يجري تحليلها. المربعات البيضاء فرضه على هذه الصورة هي مواقع الحدث، كما تحدد المواقف الوسطى من وظائف جاوس ثنائية الأبعاد تركيبها على الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على كل موقع الحدث أو اضغط على مفاتيح المؤشر لدورة بين الأحداث. على القيام بذلك للطرح الخلفية، ممهدة التمويه التغييرات نسبة مضان (ΔF / F 0) في كل من هذه المواقع التحديث في نافذة D. ملاحظة: أبرز الأحداث الأحمر مصممة على أن تنشأ من موقع معين وليس من &quot;ينزف من خلال&quot; من النشاط المترجمة إلى المواقع المجاورة. يشير التتبع الأزرق السفلي حيث إشارة مضان في الموقع المختار تجاوزت الكشفالعتبة، في حين يحدد خط أسود الأحداث القادمة من هذا الموقع بالذات (الموافق الحمراء أبرز الأحداث). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على اللون الأحمر أبرز حدث لتحديث نافذة E الذي يعرض التطور الزمني لهذا الحدث، ونافذة F الذي يعرض الملف الشخصي المكاني للحدث على مدى متوسط ​​الحال وقتها، جنبا إلى جنب مع الشخصية المكاني وظيفة جاوس المجهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراجعة الأحداث التي تم تحديدها بحيث يمكن رفض القطع الأثرية من تحليل يدويا. حذف مثل هذه الأحداث من خلال النقر الحق الحمراء أبرز الأحداث. ملاحظة: في أيدينا، كاليفورنيا 2+ تدفق من خلال قنوات IP 3 R واحدة تثير إشارات مع ΔF / F 0 حول 0.11، لذلك من المحتمل أن تكون ايجابيات كاذبة أي &quot;الاحداث&quot; الكشف عن أصغر بشكل ملحوظ من هذا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات عن طريق اختيار &#39;حفظ إلى Excel &quot;أو تصدير البيانات على أساس لكل خلية عن طريق رسم حول الخلية من الاهتمام واختيار&quot; حفظ CellR17 ؛. يتم حفظ البيانات إلى نفس المجلد مثل صورة كومة الأصلي: ملاحظة. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

نحن هنا وصف البروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في خلايا الثدييات مثقف باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية مع واجهة مستخدم بديهية بأتمتة تحديد وتحليل البيانات التي حصل عليها. الإجراء الموضح هنا الاستفا?...

أيونات الكالسيوم (الكالسيوم 2+) تنظيم بتواجد مطلق مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، إفراز وتغييرات طويلة الأمد في اللدونة متشابك 1. طريقة واحدة يمكن من خلالها الكالسيوم 2+ يمكن أن تعمل بطريقة مختلفة يتم من خلال أنماط المكانية والزمانية مختلفة من الكالسيوم 2+ اشارات يمكن خلية تولد. على سبيل المثال الارتفاعات العالمية في عصاري خلوي [كا 2+] انكماش الزناد في أنسجة العضلات الملساء 2 في حين أن أصغر، ارتفاعات عابرة مترجم (المحلية الكالسيوم 2+ microdomains) تحفيز التعبير الجيني أساسي للتعلم والذاكرة 3. عصاري خلوي مجانا [كا 2+] هو الحفاظ على ~ 100 نانومتر في بقية، ولكن يمكن أن يرتفع بسرعة لعدة الجزئي الضرس في أعقاب تدفق الكالسيوم 2+ في العصارة الخلوية من خلال الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable الموجود في غشاء البلازما والتي تحرير الكالسيوم 2+ من الصورة داخل الخلاياTORES. يركز مختبرنا على إينوزيتول 1،4،5-trisphosphate مستقبلات (IP 3 R)، الذي يشكل الكالسيوم 2+ قناة الإفراج الموجود في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER). على ملزمة لكلا IP 3 والكالسيوم 2+ إلى عصاري خلوي تفعيل مواقع مستقبلات، تفتح R قناة IP 3 لتحرير الكالسيوم 2+ المحتبسة داخل التجويف ER. الافراج عن الكالسيوم 2+ قد تبقى مقيدة مكانيا لمجموعة صغيرة من IP 3 روبية لتوليد microdomain عصاري خلوي المحلية من الكالسيوم 2+ (كاليفورنيا 2+ نفخة 4) أو، اعتمادا على قربها من التجمعات المجاورة IP 3 روبية، قد نشر عبر خلية من خلال تجنيد مواقع نفخة متعددة من خلال عملية الكالسيوم 2+ يسببها الكالسيوم 2+ -release (CICR) 5،6. إدخال الأصباغ مؤشر جزيء صغير الفلورسنت الكالسيوم 2+ التي وضعتها روجر تسين 7، إلى جانب متقدمة المجهري imagi<html> تقنيات نانوغرام، سهلت بشكل كبير فهمنا من الكالسيوم 2+ الإشارات. التطورات الحديثة في الكاميرات المستخدمة للفحص المجهري يسمح الآن لتصوير عابرة المحلية الكالسيوم 2+ أحداث مثل نفث مع القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD تمكن التصوير مع 128 × 128 بكسل في&gt; 500 لقطة في الثانية -1 (FPS) والجيل الجديد من مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات توفر (CMOS) كاميرات دقة أعلى بكسل، وحتى سرعة أكبر على حساب ارتفاع طفيف مستويات الضوضاء. بالتعاون مع الانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) المجهري أصبح من الممكن الآن أن صورة واحدة الكالسيوم 2+ أحداث قناة 8،9. هذا النهج يتيح للتصوير المئات من القنوات / الأحداث في وقت واحد، في حين توليد مجموعات البيانات الكبيرة (حوالي 1GB لكل دقيقة) التي تجعل المعالجة اليدوية، وتحديد البصرية والتحليل غير عملي ووضع المسؤولية على عاتق تطوير خوارزميات الآلي. الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; هنا، نقدم إجراءات وبروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. علينا أن نظهر المزيد من خوارزمية وضعت في بيئة بيثون المصدر المفتوح بأتمتة تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث المصورة من قبل كل من TIRF والتقليدية مجالا واسعا برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) المجهري. على الرغم من أن وصفنا هذه النهج في سياق IP 3 -generated الكالسيوم 2+ إشارات، فهي قابلة بسهولة لدراسة التغيرات المحلية في عصاري خلوي [كا 2+] المنبثقة عن مجموعة متنوعة من الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable تقع في أي سطح غشاء أو عضيات داخل الخلايا 8-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

عصاري خلوي كا 2+ أيونات تنظم جوانب عديدة من النشاط الخلوي في جميع أنواع الخلايا تقريبا، والعمليات كما واسع النطاق كما النسخ الجيني، استثارة الكهربائية وتكاثر الخلايا السيطرة. تنوع وخصوصية الكالسيوم 2+ إشارات مستمد من الآليات التي يتم إنشاؤها الكالسيوم 2+ إشارات للعمل على نطاقات زمنية ومكانية مختلفة، بدءا من التذبذبات على مستوى الخلية وموجات تحدث خلال فترات دقيقة لمحلية عابرة الكالسيوم 2+ microdomains (الكالسيوم 2+ نفث) ميلي ثانية دائمة. تضاعفت التطورات الحديثة في الإلكترون CCD (EMCCD) الكاميرات تسمح الآن للتصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات مع قرار المكاني 128 × 128 بكسل وفقا لأسعار&gt; 500 لقطة في الثانية -1 (إطارا في الثانية). هذا النهج هو مواز للغاية ويمكن رصد في وقت واحد من مئات القنوات أو المواقع نفخة في تجربة واحدة. ومع ذلك، فإن كميات هائلة من البيانات ولدت (حوالي 1 غيغابايت بيص دقيقة) تجعل التعرف البصري وتحليل الكالسيوم المحلي 2+ الأحداث عملي. نحن هنا وصف وشرح إجراءات الاستحواذ، والكشف، وتحليل IP المحلي 3 بوساطة الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة محملة الكالسيوم 2+ المؤشرات باستخدام كل واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية وضعت داخل المصدر المفتوح البرمجيات بيثون البيئة بأتمتة تحديد وتحليل هذه الكالسيوم 2+ إشارات المحلية. الخوارزمية يموضع مواقع الكالسيوم 2+ الإفراج لقرار الفرعي بكسل. يسمح للمستخدم باستعراض البيانات؛ والنواتج متواليات وقت إشارات نسبة مضان جنبا إلى جنب مع السعة والبيانات الحركية في جدول Excel متوافق مع.

الشكل 1A يظهر صورة WF من الراحة كال-520 مضان في الخلايا العصبية SH-SY5Y الإنسان أيضا محملة CI-IP 3. تعرض هذه الخلايا إلى ومضة 100 مللي ثانية الأشعة فوق البنفسجية إلى الصورة الإفراج ط-IP 3 أثارت عابرة الكالسيوم 2+ نفث في مواقع منفصلة (لاحظ الدوائر البيضاء ف...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Views.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Video: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.