وفرت الدعم المالي ويلكوم ترست (جائزة لكبار الشخصيات وJSY 074128 زمالة بحوث لKLB). مجلس البحوث الطبية دراسية للRJA ويستند Leica_SP2_Stacker ، خوارزمية تستخدم لاستيراد المشاجرات ل &#39;إعادة البناء&#39; في سلسلة ، على Leica_tiff_sequence المساعد لايكا SP2 قراءة في ImageJ المشاجرات ، التي وضعها توني كولينز واستخدامها بإذنه. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg وTurboReg ، تستند الخوارزميات المستخدمة لتصحيح حركة الأنسجة ، وعلى venaz ث وزملاؤه (1998) 9. وقد كتب Excel_writer.jar بواسطة كورت دي فوس (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). ويستند JNCT0.08JoVE.ijm ، الخوارزمية الكشف عن الجسيمات ، على خوارزمية كتبه الدماغ كوالا لمبور ومفصلة من قبل 5.

الجزء 1 : إعداد كا 2 + المؤشر (اوريغون الأخضر 488 - BAPTA 01:00) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 يأتي في 500 قارورة AM ميكرولتر وكمية صغيرة (50 ميكروغرام) من مسحوق. إضافة Pluronic 40 ميكرولتر F - 127 حل لمسحوق ، والهز برفق لمدة 30 ثانية ، ثم يضاف 460 PSS ميكرولتر ، ويهز بلطف لمدة 30 ثانية. الحل النهائي ، و 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 صباحا ، ويوفر 4 × 125 aliquots ميكرولتر. تجنب التعرض للضوء وتخزينها على سي -20 </li></ol> الجزء 2 : كا 2 + التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المؤشر + كا 2 (ولاية أوريغون الأخضر 488 - BAPTA 1:00) من التجميد (-20 م) والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ 1 مل من جهاز الأمن الوقائي في أنبوب اختبار وضعها في حمام ماء. يا فقاعة مع 95 ٪ 05/02 ٪ CO 2 بمعدل حوالي 1 فقاعة الظهور في الثانية الواحدة. عوامات ويجب أن يكون المضمون في أنبوب اختبار ، وعلى سبيل المثال مع كدر أو مع Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة من الحيوانات ، وطبق بيتري Sylgard مبطنة ، وإزالة بعناية النسيج الضام. بغض النظر عن نوع الجهاز العضلات الملساء ، ينبغي الاستعاضة عن كل PSS دقائق (10) ويجب غسلها جيدا الأنسجة (على سبيل المثال عن طريق استبدال جهاز الأمن الوقائي ثلاث مرات) تشريح التالية. لالأسهر : النظر في قطع الجهاز طول الطرق لإنتاج ورقة من الأنسجة. لالمثانة البولية : فتح طوليا من عنق المثانة (الخلفي) على الجزء العلوي من القبة (الأمامية). إعداد أربعة شرائط ، 6 -- 8 مم طويلة و 1 -- 2 ملم واسعة ، على طول السطح الظهري للالنافصة ، وقطع في اتجاه الحزم العضلات المهيمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تشريح الأنسجة في جهاز الأمن الوقائي &quot;ما قبل تحسنت وانفجر&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 ميكرولتر من 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA - 488 1:00 إلى أنبوب اختبار ويعطي يهز قليلا ، من جهة ، وإلى مزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف محتدما ويترك ، مع تغطية احباط. الوقت المستغرق لأنسجة كافية لتناول الكالسيوم 2 + مؤشر يتفاوت مع حجم الأنسجة وسماكة طبقة العضلات الملساء. على سبيل المثال : 70 دقيقة (الماوس النافصة ، anococcygeus الجرذان) إلى 120 دقيقة (النافصة الجرذ ، الفأر الأسهر). </li></ol> الجزء 3 : إعداد &quot;كا 2 + تحميل&#39; الأنسجة للفحص المجهري حذرا من النسيج تعلق أمر ضروري من أجل تقليل حركة عفوية من النسيج (خاصية التصوير من خلايا العضلات الملساء من الأنسجة سليمة نسبيا) ، وتيسير موقع موقع مناسب للتصوير (كما شقة قطعة من النسيج قد يكون الاستطلاع في بعدين ، بدلا من ثلاثة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في PSS انفجر ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل في إعداد طبق Sylgard مبطنة ، وتمتد إلى الأنسجة (قليلا) لتشكيل ورقة مسطحة. تجنب استخدام الطويل &quot;دبابيس&quot; التي قد تخدش الهدف ، واستخدام أطوال قصيرة بدلا من 25-50 ميكرون قطر الأسلاك الفضية ب &quot;دبابيس&quot; وتدرج في زاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف إعداد طبق على المسرح المجهر ، والحرص على التأكد من أن PSS لا الهروب من منطقة Sylgard مبطنة للطبق (لأن هذا قد يؤدي إلى تغطية منطقة كبيرة يجري في جهاز الأمن الوقائي ، وعندما يبدأ superfusion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مضخة من أجل إعداد superfuse مع PSS. غالبا ما يتم توظيف نسبة 100 مل للساعة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل في وحدة تدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب تدفق وتدفق ، والتحقيق في درجة الحرارة على طبق التحضير (لصق كل لقطاع المعادن بواسطة المغناطيس على قاعدتها). فإن ارتفاع غيض من أنبوب تدفق تحديد عمق PSS. توخي الحذر لضمان تدفق هو في الواقع إزالة PSS (كما هو الحال في بعض الأحيان ليس في البداية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة في وحدة سخان للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، على سبيل المثال 33-35 C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتوازن الأنسجة لا يقل عن 10 دقيقة. </li></ol> الجزء 4 : اختيار موقع لصورة التعرض للإضاءة والإثارة photobleach المؤشر ، وبالتالي تجنب استخدام أكثر من بضع ثوان في كل مرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع هدف منخفضة الطاقة (10X أو 20X) استخدام epifluorescence ومثيرة مع ضوء أزرق ، لعرض العضلات الملساء ، وتحديد منطقة مناسبة لمراقبته. محاولة لاختيار الموقع على أساس : الحركة (التي يجب أن يكون الحد الأدنى) ، وعدد خلايا العضلات الملساء في هذا المجال. &quot;هياكل&quot; مشرق قد يسبب عددا كبيرا من &quot;ايجابيات كاذبة&quot; في صورة خوارزمية الكشف ، وبالتالي تجنب المواقع التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا (على سبيل المثال) أو الظهارية يتخلل الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى هدف أكبر من الطاقة (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير مرحلة أو المحور البصري حتى الخلية العضلات الملساء (ق) وتقع الأفقية (الموازية للمحور أي مسح سريع). </li></ol> الجزء 5 : متحد البؤر المجهري تفاصيل عن كيفية &quot;إعداد&quot; المجهر مبائر محددة لكل نوع المجهر ، ولكنالاعتبارات الرئيسية هي : السرعة (هو الحد الأدنى المطلوب من 5 هرتز لمعظم العابرين كا + 2) ، والقرار وحجم الحقل (وكلاهما يتاجر حالا مع السرعة). بعض بروتوكول التالية محددة إلى مجهر لايكا SP2 مبائر تستقيم. بروتوكول نموذجي هو : 100 سلسلة الإطار ، حصلت على 5 هرتز (256 × 256 بكسل ، حوالي 100 × 100 ميكرون) أو 13.5 هرتز (256 × 64 بكسل ؛ حوالي 100 × 25 ميكرون). رئيس مجموعة مسح للتحرك ثنائي إتجاهي (لتحقيق أقصى قدر من السرعة الاستحواذ) والحصول على 1000 هرتز في كل سطر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الثقب إلى &quot;القرص مهواة&#39; واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة ليزر (488 نانومتر) على السلطة بين 25 و 35 ٪ على AOTF ؛ هذه القيمة هي مفاضلة بين السطوع وphotobleaching. (وهذا الأخير هو مشكلة خاصة خلال تسجيلات طويلة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ست مجموعات في كل موقع ، و4-6 في مواقع &quot;المعاملة&quot;. انها لهدف مشترك لمراقبة نفسه قبل ستة مواقع للمخدرات (&quot;السيطرة&quot; على سبيل المثال) وآخر من المخدرات ، على الرغم من photobleaching كبيرة قد يسبب المجرب لتحيد عن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري مع كا 2 + التصوير التي يتم تنفيذها &quot;ضوابط الوقت&quot;. </li></ol> الجزء 6 : إعداد لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت صورة من J : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. تحميل النسخة منصة محددة ، ومن ثم التحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تحميل أحدث ملف imageJ.jar من http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar ، ليحل محل الملف القديم. التفاح مستخدمي ماك : إذا كان يعمل ببطء ، تأكد من أنك تستخدم أحدث إصدار من الجهاز الظاهري جافا (JVM) متوفرة من Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Excel_writer.jar من : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html وتثبيت الإضافات في [الدليل] جرة&gt; الدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ الملفات التالية إلى الدليل الإضافات : Leica_SP2_Stacker.class ؛ JNCT0.08Release.ijm. تثبيت كل من هذه البرامج النصية باستخدام الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... ImageJ ظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر لايكا مبائر SP2 ، البرنامج (لايكا LCS) الذي يولد كل سلسلة ك &quot;فيلم&quot; واحد للعرض داخل البرنامج ، ولكن كما يوفر الأطر الفردية. لإعادة بناء الأطر في سلسلة : (ط) تأكد من أن كل &quot;إطارات&quot; من أجل إعادة بنائها في مجلد واحد (مثل &#39;DataFolder&gt; المشاجرات&#39;). (ثانيا) حدد الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; Leica_SP2_Stacker. حدد الدليل الجذر (على سبيل المثال &#39;DataFolder&#39;). حدد المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة (&#39;المشاجرات /&#39; مثلا). حدد الدليل الإخراج أو إنشاء واحدة جديدة (&#39;DataFolder&gt; الأكوام&quot; مثلا). البرنامج النصي ثم إعادة بناء سلسلة من الأطر الفردية. </li></ol> الجزء 7 : تصحيح للحركة رغم أنه قد يكون مصغرا الحركة من موقع تصوير مع يعلقون جيدة والأنسجة بالتساوي طاقتها ، وبعض الأجهزة تقلصات العضلات الملساء المعرض العفوية التي لا يمكن إلغاؤها من جانب الحذر تعلق وحدها. نحن هنا وصف استخدام خوارزمية متاحة بحرية أن تؤيد أو إطارات مباريات ضمن سلسلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنزيل &quot;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) و &quot;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت كل الإضافات إلى الدليل باستخدام الإضافات&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كدسة بحيث تتم معالجتها (ملف&gt; فتح...) ونقل بعد ذلك إلى الإطار الذي يظهر بوضوح في مجال الاهتمام. وسوف تكون محاذاة الإطارات الأخرى في هذا الإطار المرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات&gt; مداخن&gt; StackReg. حاول كل من &quot;التحولات&quot; مختلفة (أي الترجمة ، هيئة جامدة ، تناوب مقيس ، أفيني) لتحديد ما هو الأكثر فعالية. (مزيد من التفاصيل : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> الجزء 8 : الجسيمات خوارزمية الكشف لكل &quot;موقع&quot; المصورة ، وسوف تختلف العوامل التي تؤثر على الكشف عن كا 2 + العابرين. من خلال قياس بعض خصائص كل موقع (&#39;المعلمات الجسيمات&#39; -- مفصلة أدناه) ، مما يسهل عملية الكشف. وهكذا في كل موقع ، واحد يحسب &#39;عتبة طرح&#39; ، &#39;الحد الأدنى لنسبة&quot; و &quot;عتبة حافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; تثبيت... ثم اختر &quot;JNCT0.08Release.ijm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة] تحميل&gt;&gt; وحدات الماكرو المكدس (اختصار : لتر). حدد سلسلة وحساب المعلمات الجسيمات : <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ. عتبة لطرح (= الخلفية) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عائد الاستثمار مستطيلة على ما كنت تعتقد أن &#39;خلفية&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). يدون يعني. <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب. حساب الحد الأدنى لنسبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مستطيلالعائد على الاستثمار في جميع أنحاء منطقة مسطحة بصريا من الخلية (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). علما الانحراف إلى أسفل وقياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من تكرار مرتين أو يمكنك رسم ثلاثة صناديق في آن واحد عن طريق الضغط على &quot;التحول&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ويدون عتبة نسبة = (1 + SD / الوسط) × 32 ، بمتوسط ​​القيم من ثلاثة مكررات / المواقع. <ol style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ج. خلية حافة عتبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; مداخن&gt; Z المشروع... اختيار نوع الإسقاط : &quot;كثافة متوسط&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; ضبط&gt; العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأبيض والأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف &quot;ضمن&quot; (التمرير العلوي) والحد من انخفاض قيمة علما المقابلة (على يمين شريط التمرير). وسيتم احتساب فقط الأحداث التي تحدث في مناطق السود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إعادة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المداخن (اختصار : 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما عليك سوى اختيار سلسلة واحدة في هذه المرحلة ، أي &quot;الملف الأول&quot; و &quot;الملف الأخير&quot; يجب أن تكون هي نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل قيم &quot;عتبة طرح&#39; &#39;عتبة نسبة&#39; ، و &#39;عتبة حافة الخلية. ترك الإعدادات الأخرى في قيمها الافتراضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تنتج الخوارزمية إطار ثنائي في الجزء الذي يظهر في سلسلة معالجتها على اليسار وعلى اليمين الأصلي. من خلال هذا الانتقال بعناية لتقييم عدد من ايجابيات كاذبة والمناسبات التي لم تكن الأحداث ، مرئية بالعين ، تم الكشف عنها. للحصول على كشف أدق من كا 2 + العابرين قد يكون من الضروري تعديل طفيف على بعض من &#39;المعلمات الجسيمات. في حين أن العملية قد تبدو &quot;ضرب وتفوت&quot; قليلا في المحاولة الأولى ، واحد يحصل بسرعة على ما يشعر المعلمات الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل سلسلة ، الخوارزمية ينتج ملف Excel الذي تفاصيل خصائص الحدث الكشف (مثل المنطقة ، وموقف السعة). &quot;ايجابيات كاذبة&quot; -- التي تم تحديدها من خلال مراجعة ملفات الصور التي النواتج الخوارزمية (مثل الخطوة 8.17) -- يمكن إزالتها ، من جهة ، وهذا من ملف Excel. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

وبذلت جهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتهم ، وأجريت التجارب في جميع وفقا للحيوانات المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) عام 1986 وقانون المجتمعات الأوروبية توجيه المجلس 86/09/EEC.

اختيار الفلورسنت كا 2 + مؤشر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 حيث تم اختيار AM كا 2 + المؤشر لأنه (ط) هو مشرق مقارنة بالمؤشرات الأخرى (مثل Fluo - 4 والأخضر الكالسيوم) 1 ؛ تركيز + (ب) هو حساسية للتغيرات فسيولوجية في كا 2 مع د K حجم مماثل من 1 إلى داخل الخلايا كا 2 + تركيز [كا 2 +] ط (مثلا الأسهر 2) ، (الثالث) يحمل الكثير من خلايا العضلات الملساء ، مما السلس اقتران الخلايا العضلية ليتم رصدها. ومع ذلك ، ولاية أوريغون الخضراء BAPTA - 488 01:00 هو غير ratioable كا 2 + المؤشر ، ولا يمكن بسهولة مثل استخدامها لتحديد المطلق [كا 2 +] ط. وعلاوة على ذلك ، فإنه قد العازلة أيضا كا 2 + اذا كان حاضرا في تركيزات عالية وتصبح مشبعة مع التغيرات في السعة العالية [كا 2 +] ط. تثبيط انقباض عفوية قد يكون خفض انقباض عفوية الأجهزة العضلات الملساء عقاقيري ، مثل حظر حركة كا 2 + من خلال نوع L - كا 2 + قنوات (مثلا : النيفيديبين 3 ؛ ديلتيازيم 4). علما أن هذه الأدوية سوف يقلل كثيرا من سعة كامل الخلية كا 2 + ومضات / العابرين. تقلص الأسهر النتائج من مزيج من النقل العصبي في المقام الأول وpurinergic noradrenergic. تنسيق كا 2 + العابرين في هذه الأنسجة ، ولكن ، حساسة للحصار مستقبلات noradrenergic (مثلا α 1 الأدرينية ، التي برازوسين 5) حتى يمكن تقليل الحركة دون أن يؤثر ذلك التنسيق كا 2 + العابرين. بدلا من ذلك ، قد يتم منع الانكماش &#39;المصب&#39; عن طريق تثبيط ضوء سلسلة الميوسين مثل كيناز بواسطة wortmannin 6. الاستنتاجات رصد كا 2 + مضان في القرار submicron هي تقنية قوية لدراسة آثار ما بعد الإفراج صلي 5،7 العصبي ، والإفراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية (مثل &quot;الشرارات&quot; 8). تحليل كا 2 + العابرين باستخدام المنهجية المذكورة هنا هي فعالة من حيث التكلفة مقارنة المتاحة تجاريا حزم ويسمح تحليل الصور مصممة خصيصا من خلال تحليل الإضافات جافا مخصصة لكتابة ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

كاليفورنيا 2 + التصوير من العضلات الملساء ، رؤية ثاقبة الآليات الخلوية التي قد لا تسفر عن تغييرات محتملة في الغشاء ، مثل الافراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية ، ويسمح لخلايا متعددة في وقت واحد يمكن رصدها لتقييم ، على سبيل المثال ، في اقتران المخلوي الأنسجة. التحت خلوية كا 2 + العابرين شائعة في العضلات الملساء ، ولكن يصعب قياسها بدقة بسبب المشاكل الناجمة عن وقوعها العشوائية ، أكثر من حقل واسع في كثير من الأحيان من العرض ، في الجهاز الذي يجعله عرضة للتعاقد. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات والتصوير الروتينية للحصول على تحليل ومن ثم تحليلها ، وبطريقة آلية ، والتردد ، والموقع والسعة من مثل هذه الأحداث. بينما يمكن تطبيق هذا النهج في سياقات أخرى ، عملنا يشمل الكشف عن purinergic كا 2 + العابرين المحلية لتحديد مواقع اطلاق سراح الارسال مع القرار submicron. ATP يتم تحريرها باعتبارها cotransmitter من الأعصاب اللاإرادية ، حيث يربط P2X1 المستقبلات في العضلات الملساء للالنافصة والأسهر. كاليفورنيا 2 + يدخل العضلات الملساء ، مما أدى إلى purinergic neuroeffector العابرين كا + 2 (NCTs). الاتصال كا 2 + العابرين تسمح برصد البصرية الإفراج العصبي بطريقة العديد من المزايا أكثر من الكهربية. وبصرف النظر عن القرار المكانية تحسنت كثيرا ، وتسجيل البصرية لديه ميزة إضافية تتمثل في السماح للتسجيل من مواقع الارسال الافراج مميزة كثيرة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك ، فإن الطائرة الضوئية التركيز هو أسهل للحفاظ على أو تصحيح خلال سلسلة طويلة من تسجيل هو ضعيتها microelectrode an حادة داخل الخلايا. باختصار ، هو وضع الخطوط العريضة لطريقة التصوير من كا 2 + مضان الذي تفاصيل إعداد الأنسجة ، واقتناء وتحليل البيانات. نحن مخطط استخدام البرامج النصية عدة لتحليل مثل الكالسيوم 2 + العابرين.

Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

تفاصيل أساليب عالية الدقة كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.1K Views.  University of Oxford. تفاصيل أساليب عالية الدقة كا 2 + التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.

Video: Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...