ويتم تمويل هذا العمل من قبل DFG.

<html> النحل التحضير والعودة ملء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصيد العلافون عسل النحل في الخلية والبرد على الجليد لتجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل زجاجي في تسجيل 3 غرف. إصلاح العين والصدر على جدران الغرفة مع تسجيل انخفاض ذوبان الشمع نقطة الثابت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الزجاج الشعيرات الدموية كما يستخدم عادة لالكهربية وكسر في طرف من الحصول على القطر غيض من كاليفورنيا. 10μm. تغطية غيض من شعري مع عجينة صبغ. صبغ معجون يتكون من خليط من 10:01 Fura - 2 ديكستران يسين ويمكن حلها ديكستران tetramethylrhodamine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلوين الداخلي شل هوائيات مع تفصيلات أو eicosane ن. إزالة قطعة من إهاب فوق الدماغ والغدد وتدفع القصبة الهوائية إلى الجانب للسماح بالوصول إلى الجسم الفطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الشعيرات الدموية في سوما إما أو منطقة محواري الجسم من الخلايا العصبية الفطر. يمكن القيام بذلك يدويا أو باستخدام مجانا تتلاعب الجزئي. ثم استعادة قطعة إهاب على كبسولة الرأس وتخفيف هوائيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية النحل بمحلول سكروز 30 ٪ قبل تخزينها في قضية ترطيب لما لا يقل عن أربع ساعات أو أكثر من ليلة عند 20 درجة مئوية. </li></ol> التصوير في فيفو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع تحركات مثل النحلة مع قطعة صغيرة من الإسفنج التي تضغط على البطن وثابت مع مقطع أو الشريط إلى غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع الحركة من الدماغ الناتجة عن الضخ من المريء ، وقطع شق صغير في إهاب فوق شفا والانسحاب بعناية المريء وهياكلها الصلبة المحيطة بها لوضعها تحت التوتر دون الإضرار المريء 4. مع تغطية عنصر السيليكون اثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الثقوب بإبرة وأسلاك كهربائية إدراج لتسجيل M17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة إهاب والقصبة الهوائية والغدد فوق الدماغ. heamolymph تمتص داخل الكبسولة الرأس مع قطعة من الورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الكبسولة مع رئيس عنصر السيليكون اثنين. من المهم أن يتم تغطيتها بالكامل في الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النحلة على خشبة المسرح مكان المجهر ووضع قطرة من الماء على سطح سيليكون أن تزج الهدف تراجع من المجهر في الحبرية. التركيز على الخلايا العصبية الملون. </li></ol> التحفيز الرائحة وتسجيل إشارات Olfactometer : نحن نستخدم جهاز كمبيوتر مخصص للرقابة جهاز تحفيز بناء أو &quot;olfactometer&quot; كما هو موضح سابقا Galizia وفيتر 3. مخففة الروائح الى تيار الهواء المستمر موجهة نحو الهوائيات. أي حافز يتكون من نبض 3S رائحة من الهواء رائحة 0.2ml المشبعة. ويمكن ضبط بروتوكول التحفيز في تسجيل TILLVision البرمجيات. المجهر والتصوير انشاء : نحن نستخدم المجهر زايس مضان. وتسجل الصور على 25 درجة مئوية مع معدل أخذ العينات من 5 هرتز باستخدام جهاز التصوير الحراثة الضوئيات التي شنت على المجهر. يتم تسجيل إشارات الكالسيوم خلال X60 ، أوليمبوس W تراجع 0.9 الهدف مع كاميرا CCD يافعة (640X480 بكسل ، 4X اهمال على رقاقة ل160X120 بكسل). هو متحمس Fura - 2 مع ضوء أحادي اللون من 340 والطول الموجي 380nm لقياسات ratiometric. تم الكشف عن مضان من خلال مرآة مزدوج اللون 410nm 440nm وتصفية تمريرة طويلة. يتم تعيين المعلمات للتسجيل في برنامج التسجيل. يستمر كل قياس يمكن تعديلها 10S وزمن التعرض للموجات اثنين إلى تلطيخ كثافة في كل إعداد. M17 التسجيل : يتم تسجيل العضلات المنقلة من الشفة (M17) خارج الخلية لرصد ردود الفعل السلوكية المتصلة التعلم ، أي 5 في (6). حقن الأسلاك النحاسية في العضلات القريبة من أجزاء الفم. حقن الكهربائي الأرضي في العين. وتتضخم إمكانات العضلات مع مكبر للصوت ما قبل بناء العرف ، رقمية وتخزينها على جهاز الكمبيوتر. يتم تشغيل بداية التحفيز التي olfactometer. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال التجربة : يتم تغذية تسجيلات للإشارة إلى الكالسيوم كمبيوتر وتخزينها. ويسمح برنامج تسجيل TILLVision تفتيشا أوليا للإشارات ، مثل حساب النسبة بين الطول الموجي (340nm/380nm) وحساب deltaF (الطرح من الأساس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم معالجة الصور مع العرف البرامج المكتوبة في IDL. حساب نسبة الكالسيوم 2 + إشارات من 340nm 380nm وقياسات لكل بكسل. تحديد مضان الخلفية (F) من المتوسط ​​خلال أطر قبل التحفيز وطرح من إشارة ratiometric (deltaF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد منطقة سياحية (ROI) : يعني حساب من الإطارات خلال التحفيز وتطبيق مرشح تمرير منخفض (3X3px). تحويل مقياس رمادية اللون على نطاق وكاذبة. تحديد نشاط الخلايا العصبية في الهياكل كبقع النشاط في الصور الملونة وكاذبة وتحديد العائد على الاستثمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ديناميكية الزمني للمناطق نشطة عن طريق حساب متوسط ​​العائد على الاستثمار في بكسل على جميع الإطارات دون أي تصفية أو التصحيح. </li></ol>&gt; التحليل الصرفي والإعمار جنبا إلى جنب مع ديكستران Fura - 2 ملأنا الخلايا العصبية مع ديكستران يمكن حلها رودامين صبغ (&quot;مصغرة روبي&quot;). كلا الأصباغ لها نفس الوزن الجزيئي ، وينبغي أن تشارك في الموجود في الخلايا العصبية. مجال التصوير واسع يسمح القرار الوحيد المكانية محدودة للغاية ، ولذلك فمن المستحسن للتحقيق في الهياكل الملون بعد التجربة باستخدام المجهر متحد البؤر المسح الضوئي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القياسات الفسيولوجية ، وتشريح أدمغة يحملق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في برنامج تلفزيوني ويذوى متدرج في الإيثانول واضحة في salycilate الميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتضمين المجهري مبائر الدماغ في salycilate الميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر لايكا SP2 TCS. الطول الموجي 543nm هو الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن مسح الدماغ مع الهواء أو الزيت الهدف الغمر وقارن بين الهياكل ملطخة البيانات التصوير. </li></ol> ممثل النتائج : إذا كان التلوين وإعداد ناجحة ، في إشارة نطاق اللون كاذبة ، على سبيل المثال في الخلايا العصبية هيئة فطر الفص ألفا خارجي ، يمكن أن تبدو في الشكل 1. ويمكن حساب الاستجابة السلوكية (PER) كما تردد خلال تصاعد وتيرة ارتفاع ناقص التحفيز قبل التحفيز (figure2). قد يكون التحقيق في هياكل ملطخة بمزيد من التفصيل باستخدام المجهر مبائر (figure3). <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : الممثل اشارات التصوير الكالسيوم (التحفيز مع هيبتانال). ج : المصور المنطقة من الدماغ النحل. باء : صورة الفلورية الخام كما رأينا من خلال تراجع X20 الهدف في الطول الموجي 380nm الإثارة ، هي الخطوط العريضة لشحمة ألفا من الجسم الفطر في الأرجواني. تم حقن صبغة في حافة البطن - الجانبي للفصوص ألفا لصبغ الخلايا العصبية خارجي. أوجز ROI مختارة ألفا الفص المبينة في الأرجواني ، باللون الأسود ؛ الكاذبة صورة ملونة مستمدة من إشارة المتوسط ​​، deltaF (340/380) ، وخلال التحفيز الثلاثة الثانية : C. وأشار ديناميات الزمانية من الكالسيوم في إشارة استجابة لتحفيز السكروز من ipsi وهوائي مضاد الوحشي على التوالي على عائد الاستثمار : D : ديناميات الزمانية إشارة الكالسيوم في تحفيز استجابة لرائحة ، إشارة المتوسط ​​من منطقة الفائدة كما هو مبين في E C. في C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> الشكل 2 : الممثل M17 الاستجابة. بعد تكييف الشمية النحلة يمتد خرطوم عندما تقدم رائحة دون مكافأة. الخط الأحمر يشير إلى التحفيز الرائحة. أقحم : لكل من نحل العسل. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> الشكل 3 : الممثل المكدس الصورة. بعد تجربة التصوير كان تشريح الدماغ. يتم فحص الخلايا العصبية من الرقم 1 باستخدام المجهر مبائر مع الغمر X20 الهدف النفط ، ألفا ، المبينة في الفص الأرجواني.

<ol>
	<li>Joerges, J., K&#252;ttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain.">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li><li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+honeybee's+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings.">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li><li>Galizia, C. G., Vetter, R. S., Christensen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+for+Analyzing+Odor-Evoked+Activity+in+the+Insect+Brain.">Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain.</a> Methods in Insect Sensory Neuroscience. , 345-388 (2004).</li><li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain.">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li><li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica,+Hokaido+Univ.">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li><li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+(Apis+mellifera.">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li></ol>

في هذا العرض مررنا جميع الخطوات للتحقيق في إشارات الكالسيوم في الجسم الحي النحل. طبقنا هذه التقنية لهيئة فطر الخلايا العصبية ، ولكن يمكن أن يتم التصوير في جميع الخلايا العصبية التي يمكن أن تنشأ تقنية تلوين. وقد ركزنا على الخلايا العصبية في مسار الشمية من عس?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>low melting point hard wax Deiberit 502</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr. B&ouml;hme & Sch&ouml;ps Dental GmbH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>F-3029</td>
<td>Protect from light.</td>
</tr>
<tr>
<td>tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>D-3312</td>
<td>Protect from light.</td>
</tr>
<tr>
<td>n-eicosane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>21, 927-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik Sil Adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>KWIK SIL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Set-up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TILL Photonics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imago</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo ca2+- imaging of mushroom body neurons during olfactory learning in the honey bee

والمجراة ونصف وقد وضعت في التحضير لتصوير الكالسيوم المجراة في المختبر لدينا من قبل Joerges ، كوتنر وGalizia أكثر من عشر سنوات مضت ، لقياس النشاط رائحة أثار في الفص antennal 1. منذ ذلك الحين ، فقد كان المكرر باستمرار وتطبيقه على neuropiles مختلفة في الدماغ النحل. هنا ، نحن تصف إعداد المستخدمة حاليا في المختبرات لقياس نشاط الخلايا العصبية في الجسم باستخدام فطر يقترن ديكستران الكالسيوم الحساسة للصبغة (Fura - 2). وصمة عار علينا retrogradely الخلايا العصبية عن طريق حقن الجسم الفطر صبغة في المحاور أو المنطقة سوما. ونحن نركز على الحد من الغزو ، من أجل تحقيق التحضير الذي لا يزال من الممكن تدريب النحل باستخدام PER تكييف. ونحن قادرون على رصد وقياس ردة الفعل السلوكية من خلال تسجيل الكهربائية myograms من العضلات التي تسيطر على الواحدة (M17) 2. بعد التجربة الفسيولوجية والتحقيق في هياكل تصوير بمزيد من التفصيل باستخدام مبائر المجهري المسح الضوئي لمعالجة هوية الخلايا العصبية.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee at JoVE.com

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

يمكن أن يكون مشروطا النحل في نموذج التعلم الشمية مشهي (PER تكييف). استخدام الروائح والمحفزات ، أنشأنا طريقة السلوك التي يتم تسجيلها في حين يستخدم التصوير في وقت واحد لقياس النشاط الكالسيوم أثارت رائحة الجسم في الخلايا العصبية الفطر<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;.

الكالسيوم في الجسم الحي 2 + -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

in-vivo-ca2-imaging-mushroom-body-neurons-during-olfactory-learning

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

13.9K Views.  Freie Universität Berlin. يمكن أن يكون مشروطا النحل في نموذج التعلم الشمية مشهي (PER تكييف). استخدام الروائح والمحفزات ، أنشأنا طريقة السلوك التي يتم تسجيلها في حين يستخدم التصوير في وقت واحد لقياس النشاط الكالسيوم أثارت رائحة الجسم في الخلايا العصبية الفطر في الجسم الحي.

Video: In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible circuitry. In addition, this area's unique ability to generate new neurons throughout an organism's lifetime makes it an attractive system for developmental and regenerative biologists alike. Such interest necessitates a means for a quick, yet reliable assessment of olfactory function. Many tests of olfactory ability are complex, variable or not specifically designed for mice. Also, some tests are sensitive to memory deficits as well as defects in olfactory abilities, confounding obtained results.
Here, we describe a simple battery of tests designed to identify defects in olfactory sensitivity and preference. First, an initial general health assessment allows for the identification of animals suitable for further testing. Second, mice are exposed to various dilutions of scents to ascertain whether there is a threshold difference. Third, mice are presented with various scents, both attractive and aversive, that allow for the assessment of olfactory preference. These simple studies should make the initial characterization of olfactory behavior accessible for labs of varied resources and expertise.

Fundamental, yet unique properties of the rodent olfactory system have led to its increasing study among biologists. A relatively simple assessment of its function is then also needed. Here we describe sensitive tests for the characterization of mouse olfactory sensitivity and preference.

السلوكية اختبار الشم في الماوس الكبار

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

الجزئي للمحرك صفيف المزمنة في الجسم الحي تسجيل : تصنيع محرك

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential amplitude of action potential signatures over the channels of a tetrode allows for the isolation of single-unit activity from multi-unit signals.  The ability to precisely control the stereotaxic location and depth of the tetrode is critical for studying coordinated neural activity across brain regions.  In combination with a micro-drive array, it is possible to achieve precise placement and stable control of many tetrodes over the course of days to weeks.  In this protocol, we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes using basic tools and materials, install the tetrodes into a multi-drive tetrode array for chronic in-vivo recording in the rat, make ground wire connections to the micro-drive array, and attach a protective cone onto the micro-drive array in order to protect the tetrodes from physical contact with the environment.



Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

In this protocol we demonstrate how to fabricate and condition tetrodes for use with a micro-drive array, which was designed for chronic electrophysiological recordings in rats. In addition, we illustrate the final stages of micro-drive array construction, which includes installing ground wires and a protective cone.

الجزئي للمحرك صفيف المزمنة في الجسم الحي تسجيل : الجمعية Tetrode

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

الحصول على عينات مع تباطأ، وتسارع الشيخوخة في عكس عسل النحل النموذجي

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

طرق لمقارنة العناصر الغذائية في خبز النحل الذي أدلى به Africanized والعسل النحل الأوروبي والتأثيرات على التتر البروتين الدملمف

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...