يصف هذا البروتوكول مقايسة تولد الأوعية الدموية في المختبر التي تلخص العديد من ميزات تكوين الأوعية الدموية ويمكن استخدامها لاختبار الأدوية. هذه الطريقة سهلة التنفيذ في المختبر وقوية وقابلة للتطوير. لديها العديد من أوجه التشابه مع المقايسات باستخدام الخلايا البطانية البشرية والمجهرية.
يحاكي هذا النموذج بقوة النمط الظاهري الذي يظهر اختيار خلية الطرف البطاني المعيبة وهجرة الخلايا البطانية الموجهة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية المرضية. يمكن أن يوفر العمل نظرة ثاقبة حول الآليات التي تنظم تكوين الأوعية الدموية ، والجينات الرئيسية ، ومسارات الإشارات المعنية ، لا سيما عن طريق إجراء الفحص الجيني يتمثل التحدي الرئيسي في الحفاظ على جودة أو تعدد قدرات الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في الثقافة. من المهم التحقق بانتظام من مراحل تعدد القدرات ومورفولوجيا خطوط الخلايا.
من المهم أيضا إجراء التنميط النووي لخطوط الخلايا لأنها تميل إلى زراعة الكروموسومات أو اكتسابها. ابدأ بطلاء بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا الستة ب 500 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ ووضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الألواح المطلية بالجيلاتين باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من CM الطازج بالإضافة إلى ناقص المتوسط.
للحصول على مجموعة نقية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر أو mESCs ، قم بتثريبسين لوحة زراعة الخلايا باستخدام مخزن مؤقت 10x TVP لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط تمايز الأديم المتوسط قبل نقلها إلى صفيحة الآبار الستة المطلية بالجيلاتين لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا الليفية الجنينية للفأر بالالتصاق بينما تظل mESCs معلقة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر قبل عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم Neubauer في صبغة Trypan الزرقاء.
ثم أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من وسط تمايز الأديم المتوسط. قم بإعداد أربعة أطباق من البوليسترين منخفض المرفق 94 ملم بإضافة 15 ملليلتر من الماء المعقم إلى القاع.
بعد نقل تعليق الخلية إلى خزان بلاستيكي معقم ، قم بتحميل أربعة مواضع من ماصة متعددة القنوات مع 22 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل قناة. ارفع وضع الغطاء المقلوب للطبق مقاس 94 ملم على السطح النظيف لخزانة التدفق بحيث يكون الجانب الداخلي متجها لأعلى. قم بإيداع 40 قطرة من تعليق الخلية على السطح الداخلي لكل غطاء واقلب الغطاء بعناية دون إزعاج لوضعه مرة أخرى على الطبق ، بحيث تواجه القطرات الماء.
احتضان الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام ، معتبرا هذا يوم التمايز صفر. بعد أربعة أيام من الحضانة ، اجمع القطرات المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر باستخدام ماصة P1000. دع رواسب EB في الأنبوب قبل إزالة المادة الطافية.
أعد تعليق EBs في ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز الأوعية الدموية 2x قبل نقل معلق EB وتوزيعه بشكل موحد في طبق مطلي بالآجار 60 ملم. احتضان الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم التاسع مع تحديث متوسط كل يومين. تحضير طبق ثقافة 35 ملم عن طريق إضافة ملليلتر واحد من وسط تنبت إلى قاعه.
للحث على الهلام ، احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. اجمع EBs البالغة من العمر تسعة أيام من طبق أجار واحد في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق EBs في ملليلتر من وسط التنبت البارد لنقله إلى طبق الاستزراع المطلي بالطبقة الأولى من وسط الإنبات.
قم بتوزيع EBs في جميع أنحاء اللوحة ، مع التأكد من أنها على مسافة متساوية من بعضها البعض. يجب أن يكون تكوين البرعم الأول واضحا بعد الحضانة لمدة 24 إلى 48 ساعة تقريبا. في اليوم 12 ، استخدم ملعقة لنقل جل الكولاجين الذي يحتوي على EBs بعناية إلى شريحة زجاجية.
قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة وجفف الجل عن طريق وضع ورقة شاش من الكتان النايلون وبطاقات الترشيح الماصة أعلى الجل. ضع ضغطا بوزن 250 جراما لمدة دقيقتين. ثم قم بإزالة أوراق النايلون للسماح للشرائح بالجفاف في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التجفيف ، ثبت EBs باستخدام محلول الزنك طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة المثبت قبل غسل الشرائح خمس مرات باستخدام PBS. تتخلل EBs و PBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton X-100.
بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول النفاذية لغسل الشرائح خمس مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. احتضان EBs في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. ثم أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في المخزن المؤقت المانع واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
ثم احتضان الشرائح بالجسم المضاد الثانوي Goat anti-Rat Alexa 555 في مخزن مؤقت مانع لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ومرة واحدة بالماء قبل تركيبها للفحص المجهري. تم إجراء اختبار تولد الأوعية الدموية 3D على ثلاثة EBs مع عقارين ، DC101 و DAPT.
منع كلا المركبين تدريجيا تكوين الأوعية في نموذج EB مع زيادة التركيزات. أظهرت التركيزات المختلفة للأدوية في EBs أن الجرعات العالية من DC101 تمنع عدد وطول براعم الأوعية. كان ل DAPT تأثيرات معاكسة بجرعة ميكرومول واحد لكل لتر.
زاد DAPT بقوة من عدد خلايا الطرف البطاني لكل براعم وعاء لها نمط ظاهري مضلل حتى عند الجرعات المنخفضة ، مقارنة ب DC101. لوحظ وجود خلل في تنبت الأوعية الدموية في توسع الشعيرات النزفي الوراثي EBs من التحكم ACVRL1 والأنماط الجينية غير المتجانسة ACVRL1 مع العديد من الأنماط الظاهرية المضللة التي تنتشر بزوايا عشوائية بالنسبة للأوعية الأم. أدت مخاليط خط mESC من النوع البري بنسبة واحد إلى واحد مع خط mESC من النوع البري غير المسمى ، إلى مساهمة متساوية في خلايا الطرف البطاني الرائدة.
تم إجراء التحليل المجهري لهذا EB الخيمري التمثيلي لتحديد الأصل الجيني لخلايا الطرف البطاني الرائدة. لتحديد تغطية الخلايا الجدارية لتنبت الوعاء ، تم تثبيت EBs وتلوينها لعلامات الخلايا البطانية ، PECAM ، وعلامة الخلايا الجدارية ، أكتين العضلات الملساء ألفا. كشفت صورة عالية التكبير أن برعم وعاء فردي كان محاطا بخلايا جدارية.
تم إجراء التحويل الثنائي بعد فصل قناة اللون وتم تحديد نسبة الأوعية الموجبة PECAM التي تغطيها الخلايا الجدارية الإيجابية alpha SMA. الخلفية الوراثية لخط الخلايا الجذعية الجنينية هي أيضا عامل رئيسي يجب على الباحثين مراعاته لأن بعض الخطوط تنبت بشكل أفضل من غيرها. يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء الفحص الجيني باستخدام نهج RNAi أو بنك من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر التي تؤوي طفرات جينية.
