이 프로토콜은 혈관 형성의 많은 특징을 요약하고 약물 테스트에 사용할 수 있는 시험관 내 발아 혈관신생 분석을 설명합니다. 이 방법은 실험실에서 구현하기 쉽고 강력하며 확장 가능합니다. 그것은 인간 내피 세포와 미소 구체를 사용하는 분석과 많은 유사점을 가지고 있습니다.
이 모델은 병리학적 혈관신생으로 이어지는 결함 있는 내피 팁 세포 선택 및 방향화된 내피 세포 이동을 보여주는 표현형을 강력하게 모방합니다. 이 연구는 특히 유전자 스크리닝을 수행함으로써 발아 혈관신생을 조절하는 메커니즘, 주요 유전자 및 관련된 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 주요 과제는 배양에서 마우스 배아 줄기 세포의 품질 또는 다능성을 유지하는 것입니다. 세포주의 다 능성 단계와 형태를 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다.
세포주가 염색체를 잃거나 얻기 위해 배양하는 경향이 있으므로 세포주의 핵형 분석을 수행하는 것도 중요합니다. 먼저 6웰 세포 배양 플레이트 중 1웰을 500마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하고 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 젤라틴 코팅 판을 PBS로 세척하고 500 마이크로 리터의 갓 준비된 CM 플러스 마이너스 배지를 첨가하십시오.
마우스 배아 줄기 세포 또는 mESC의 순수한 집단을 얻기 위해, 실온에서 30초 동안 10x TVP 완충액으로 세포 배양 플레이트를 트립신화한다. 그런 다음 세포를 1밀리리터의 중배엽 분화 배지에 재현탁시킨 후 30분 동안 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트로 옮기기 전에 mESC가 현탁액에 머무르는 동안 마우스 배아 섬유아세포가 부착되도록 합니다. Trypan blue 염료의 Neubauer 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수하기 전에 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 세포를 실온에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 적절한 부피의 중배엽 분화 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 바닥에 15 밀리리터의 멸균 수를 추가하여 4 개의 94 밀리미터 저 부착 폴리스티렌 접시를 준비하십시오.
세포 현탁액을 멸균 플라스틱 저장소로 옮긴 후, 채널당 22 마이크로리터의 세포 현탁액이 있는 다중 채널 피펫의 4개 위치를 로딩합니다. 94mm 접시의 거꾸로 된 뚜껑을 들어 올려 내부가 위를 향하도록 플로우 캐비닛의 깨끗한 표면에 놓습니다. 각 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현탁액 40방울을 떨어뜨리고 방해 없이 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 접시에 다시 올려 방울이 물을 향하도록 합니다.
이산화탄소 인큐베이터에서 4 일 동안 배양하여 분화 0 일째로 간주합니다. 4 일간의 배양 후, P1000 피펫을 사용하여 15 밀리리터 원추형 튜브에 매달린 방울을 수집하십시오. 상등액을 제거하기 전에 튜브에 EB 침전물을 넣으십시오.
EB 현탁액을 60mm 한천 코팅 접시에 옮기고 균일하게 분배하기 전에 3밀리리터의 2x 혈관 분화 배지에서 EB를 재현탁합니다. 9 일째까지 이산화탄소 인큐베이터에서 2 일마다 배지를 새로 고치십시오. 바닥에 발아 배지 1 밀리리터를 첨가하여 35 밀리미터 배양 접시를 준비합니다.
겔화를 유도하려면 접시를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 15밀리리터 원뿔형 튜브에 있는 한천 접시에서 9일 된 EB를 수집하고 상층액을 제거합니다. EB를 2밀리리터의 저온 발아 배지에 재현탁하여 발아 배지의 첫 번째 층으로 코팅된 배양 접시로 옮깁니다.
EB를 플레이트 전체에 분배하여 서로 동일한 거리에 있도록 합니다. 첫 번째 새싹 형성은 약 24시간에서 48시간 동안 배양한 후 분명해야 합니다. 12일째에 주걱을 사용하여 EB가 포함된 콜라겐 젤을 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮깁니다.
피펫으로 과도한 액체를 제거하고 젤 위에 나일론 린넨과 흡수성 필터 카드의 거즈 시트를 놓아 젤을 탈수합니다. 2 분 동안 250 그램의 무게로 압력을가하십시오. 그런 다음 나일론 종이를 제거하여 슬라이드가 실온에서 30분 동안 자연 건조되도록 합니다.
건조 후 아연 용액을 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 EB를 고정합니다. 다음날, PBS로 슬라이드를 5회 세척하기 전에 고정액을 제거한다. 0.1% Triton X-100을 함유한 EB 및 PBS를 투과화합니다.
15분 후, 투과화 용액을 제거하고 슬라이드를 5분 동안 PBS로 5회 세척하였다. EBs를 실온에서 1시간 동안 블로킹 완충액에서 배양하고 PBS로 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 차단 완충액에 희석된 1차 항체를 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
이어서, 슬라이드를 염소 항-쥐 Alexa 555 2차 항체와 함께 블로킹 완충액 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 배양 후 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 세척하고 현미경 검사를 위해 장착하기 전에 물로 1회 세척합니다. 3D 발아 혈관신생 분석은 DC101 및 DAPT의 두 가지 약물을 사용하여 3개의 EB에서 수행되었습니다.
두 화합물 모두 농도가 증가함에 따라 EB 모델에서 혈관신생을 점진적으로 차단했습니다. EB의 다양한 농도의 약물은 고용량의 DC101이 혈관 새싹의 수와 길이를 억제한다는 것을 보여주었습니다. DAPT는 리터당 1마이크로몰의 용량에서 반대 효과를 나타냈습니다.
DAPT는 DC101에 비해 저용량에서도 잘못된 표현형을 갖는 새싹 혈관당 내피 팁 세포의 수를 강력하게 증가시켰다. ACVRL1 대조군 및 ACVRL1 이형접합체 유전자형의 유전성 출혈성 모세혈관확장증 EB에서 결함이 있는 혈관 발아가 관찰되었으며, 모혈관에 대해 무작위 각도로 돋아나는 수많은 잘못된 표현형이 있습니다. 일대일 비율의 야생형 mESC 라인과 표지되지 않은 mESC 야생형 라인의 혼합물은 주요 내피 팁 세포에 동등한 기여를 가져왔습니다.
이러한 대표적인 키메라 EB의 현미경 분석을 수행하여 주요 내피 팁 세포의 유전형 기원을 확인했습니다. 혈관 새싹의 벽화 세포 커버리지를 정량화하기 위해 EB를 고정하고 내피 세포 마커인 PECAM 및 벽화 세포 마커인 알파 평활근 액틴에 대해 염색했습니다. 고배율 이미지는 하나의 개별 혈관 새싹이 벽화 세포로 둘러싸여 있음을 보여주었습니다.
색 채널 분리 후 이진 변환을 수행하고 알파 SMA 양성 벽화 세포로 덮인 PECAM 양성 혈관의 비율을 정량화했습니다. 배아 줄기 세포주의 유전적 배경은 일부 계통이 다른 계통보다 더 잘 자라기 때문에 연구자들이 고려해야 하는 핵심 요소이기도 합니다. 이 방법은 RNAi 접근법 또는 유전자 돌연변이가 있는 마우스 배아 줄기 세포 은행을 사용하여 유전자 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
