انحطاط القرص الفقري يؤدي إلى درجة عالية من الضعف والألم. بروتوكولنا يسمح لنا بالتحقيق في تطوير القرص المورفولوجي وتغيراته في الانحطاط. تجعل شبكة الكولاجين الكثيفة من النوع الأول من الصعب عادة تحليل القرص الفقري عن طريق المجهر.
مع المقطع البصري، يمكننا التحقيق في الترتيب ثلاثي الأبعاد للخلايا الشوندروسيتية داخل الأنسجة المختلفة. تبدأ عن طريق وضع داخل المنطوق الحصول عليها, القرص الفقري أو عينات IVD في DMEM تكملها مع حجم 2٪ من حجم البنسلين-Streptomycin, و 1.2٪ حجم حجم Amphotericin B, بعد جمع فورا, تخزين عينات IVD في أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. إذا تم تجميد إذابة عينات IVD البشرية في درجة حرارة الغرفة وتحديد أصل أنسجة IVD البشرية على أساس الخصائص المجهرية مثل؛ الكثافة الكلية والتوجه.
لجمع الأنسجة القرص البقري، واتخاذ الجزء الحركة تتكون من IVD مع فقرتين المجاورة لها واستخدام شفرة الجراحية رقم 15، تشريح القرص البقري كله من العظام تحت الوخز، والوجه القرص للوصول إلى المناطق التي تركزت. بعد تحديد مناطق مختلفة من الغضروف، استخدم شفرة جراحية رقم 20 أو 22 لقطع منطقة الاهتمام من القرص بأكمله. وينبغي معالجة ال IVDs من الأجنة البقرية مع طول التاج الردف أصغر من 20 سنتيمترا دون تشريح.
إجراء تشارات النسيج كما هو موضح في المخطوطة. تأكيد الشارات الناجحة، إذا اخترقت إبرة قياس 20 نسيج القرص، أو إذا كان ذلك ممكنا فقرات دون مقاومة ملحوظة. بالضبط عينات الأنسجة في حجم عشرة أضعاف من محلول الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، ضع الأنسجة في وسط تضمين قابل للذوبان في الماء على مقبض Cryotome، بحيث يتم توليد إما طائرة محورية أو طائرة تقطع عموديا نوع الكولاجين الذي يتم إنشاؤه عادة. استخدم الكريوتومي القياسي لقسم الأنسجة المضمنة بسماكة 70 ميكرومتر في عينات بشرية و40 ميكرومتر في عينات الأبقار. جمع المقاطع على شريحة زجاجية قبل الشطف المقاطع ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، إضافة صبغة الفلورسنت مناسبة تليها المتوسطة المتصاعدة وتغطية المقاطع مع زلة غطاء.
ضع شريحة مع قسم أنسجة وصمة عار على حامل العينة من المجهر فلوريسكنس عن طريق بدء جهاز الإضاءة هيكل أداء مجال واحد من التصوير عرض مع مرشحات الفلورسنت والإضاءة الكافية. باستخدام برنامج تحسين الصورة المتوافق مع المجهر فلوريسينس، معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع. لتصور المقطع ككل استخدم تقنية تصوير الفسيفساء عن طريق فتح إعدادات الاستحواذ 60 من لوحة شريط الأدوات وضبط إعدادات الفسيفساء في سجل الفسيفساء.
للقيام بذلك تحديد عدد الأعمدة والصفوف من حقل صور العرض التي يجب دمجها في وقت لاحق في صورة نظرة عامة واحدة، اضغط الإعداد وضبط تصحيح التركيز من البلاط الفردية. بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع. لتحليل المنظمة chondrocyte المكانية استخدام وظيفة 3D أدرجت في البرنامج عن طريق ضبط إعدادات Z-المكدس مع زر البدء / التوقف، وتحديد المعلمات المسح الضوئي مثل البداية ووقف المواقف في محور Z والمسافة شريحة.
تحديد أنماط الخلوية الفردية واستخدام البرنامج المساعد عدد الخلايا للتحليل الكمي للأنماط الخلوية، وحساب كثافة الخلية عن طريق تقسيم الخلايا العد حسب حجم المنطقة المختارة من الفائدة. يمكن التعرف على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في أنولوس والنواة الأكثر ليونة في صور الفسيفساء التي التقطت في الطائرة المحورية والمترهلة. في المناطق المكبرة من صور الفسيفساء ، لوحظت أنماط تنظيمية مكانية مختلفة من الخلايا الشوندروية مثل ؛ خلايا واحدة وأزواج وسلاسل.
أظهرت دراسة مراحل النمو والنضج المختلفة للتليف الأبقار أنولوس انخفاضا مستمرا في الكثافة الخلوية أثناء تطور القرص الجنيني. من ناحية أخرى لوحظت كثافة خلوية متزايدة وتشكيل الكتلة في القرص البشري البالغ أثناء الانحطاط. انخفضت كثافة الخلية في المراحل المبكرة من تطور IVD في تليف أنولوس البقري ونواة البقر اللب بسرعة حتى الولادة.
من خلال تصوير القناة من IVD مع Epitome سمح التصور للهندسة المعمارية 3D من الأنماط المكانية مثل السيتوبلازم والنواة، في IVD واحد سليمة، فضلا عن أزواج من chondrocytes رصدت. في حين تم العثور على مجموعات خلايا أنولوس المنحطة. الجزء الأكثر تحديا هو تخصيص الأنسجة لأصلها وتصحيح جزءا لا يتجزأ من أجل تقسيم.
وهذا أمر ضروري للحصول على نتائج موثوقة. بعد تشريح واختيار أنسجة IVD بشكل صحيح من مراحل وأصول مختلفة يسمح لنا بتعميق التحليل من خلال مزيد من التحليل الكيميائي الحيوي والميكانيائي الحيوي ، مثل ELISA أو المجهر القوة الذرية.
