يتم استخدام تقنيات omics على نطاق واسع أكثر فأكثر في الدراسات التي تركز على السمنة. يمكن أن يكون علم الوراثة اللاجينية رابطا بين التعرض والنتائج الصحية. يولد هذا النوع من الدراسات كمية هائلة من البيانات.
بالنظر إلى ذلك ، من المهم توحيد البروتوكولات من أجل جعل البيانات قابلة للمقارنة تقنيا. في هذه الدراسة ، سنقترح خط أنابيب من أجل الحصول على بيانات مثيلة الحمض النووي وتحليلها. يمكن تطبيق نفس البروتوكول على كل من إصدارات 400K والملحمية.
اليوم الأول:علاج البيسولفيت. ابدأ بتمسخ الحمض النووي الجينومي، ثم أضف كواشف التحويل. من الضروري اتباع توصيات المجموعة.
وعلاج الحمض النووي المسخ مع ثنائي الفوسفات. ثم احتضان العينات في دورة حرارية. نفذ خطوات الغسيل باستخدام مخزن الغسيل المؤقت.
اليوم الثاني: التضخيم بعد فحص المثيلة ، البروتوكول اليدوي. سخني فرن التهجين مسبقا عند 37 درجة مئوية واسمح لدرجة الحرارة بالتوازن. تفريق 20 ميكرولتر من MA1 في آبار اللوحة.
نقل أربعة ميكرولترات من الحمض النووي إلى الآبار المقابلة على اللوحة. قم بتفريق أربعة ميكرولترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم في آبار اللوحة. ختم اللوحة مع ختم من البلاستيك.
دوامة اللوحة لخلط الكواشف مع العينات. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتفريق 68 ميكرولتر من RPM في كل بئر ، ثم 75 ميكرولتر من MSM دون إزالة المحلول السابق.
استخدم ختما جديدا لتغطية اللوحة. دوامة اللوحة لمدة دقيقة واحدة. احتضان في فرن التهجين لمدة 20 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
اليوم الثالث: التهجين بعد فحص المثيلة ، البروتوكول اليدوي. سخن الكتلة مسبقا عن طريق إدخال اللوحة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة اللوحة بعناية من فرن التهجين.
نبض الطرد المركزي لوحة. قم بإزالة الختم من اللوحة. أضف 50 ميكرولتر من FMS إلى كل حاوية عينة.
دوامة اللوحة لمدة دقيقة واحدة. جهاز الطرد المركزي الذي تحتاجه اللوحة. ثم ضع اللوحة المختومة على كتلة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
أضف 100 ميكرولتر من PM1 إلى كل بئر يحتوي على عينات. ختم اللوحة مرة أخرى. دوامة اللوحة لمدة دقيقة واحدة.
تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اخفق في جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة ، ثم أضف 300 ميكرولتر من 100٪ 2-propanol إلى كل بئر مع العينة. ختم اللوحة مرة أخرى.
امزج جميع المحتويات عن طريق عكس اللوحة 10 مرات على الأقل. تحضن عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة الختم من اللوحة.
عكس اللوحة بسرعة في مكان مناسب ، والتخلص من supernatant. اضغط بقوة عدة مرات حتى تلاحظ أن جميع الآبار خالية من السوائل. في درجة حرارة الغرفة ، اترك اللوحة مقلوبة رأسا على عقب ومكشوفة لمدة ساعة واحدة.
بعد تجفيف كل السائل ، من الضروري رؤية المنصات الزرقاء في قاع الآبار. ثم أضف 46 ميكرولتر من RA1 إلى كل بئر. ضع الختم الحراري على اللوحة.
امسك بإحكام لأداء الختم بالتساوي. ضع الطبق في فرن التهجين عند 48 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم دوامة لمدة دقيقة واحدة. انبض في جهاز الطرد المركزي ، وقم بتسخين اللوحة عند 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
قم بإعداد غرف BeadChip Hyb معا. في هذه الخطوة التالية ، قم بتفريق 400 ميكرولتر من PB2 في الخزانات في Hyb Chambers. بعد ملء خزانات Hyb Room ب PB2 ، ضع الغطاء على الفور.
قم بتحميل كل عينة بعناية من اللوحة في إدخال عينة المصفوفة الدقيقة. قم بتحميل إدخالات غرفة Hyb التي تحتوي على المصفوفات الدقيقة في غرفة Hyb. أغلق غرفة Hyb بالعرض لتجنب التحول المحتمل لغرفة Hyb.
اليوم الرابع: تلطيخ بعد فحص المثيلة ، البروتوكول اليدوي. بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة جميع المصفوفات الدقيقة من الإدراجات. واغسل المصفوفات الدقيقة ببطء وبخفة ، ما مجموعه 10 مرات ، لأعلى ولأسفل.
انقل المصفوفات الدقيقة إلى حاوية PB1 رقم اثنين وكرر 10 مرات ، لأعلى ولأسفل. ضع إطارات غرفة التدفق في الموضع الصحيح ، ثم كل مصفوفة صغيرة. استخدم فاصل شفاف في الجزء العلوي من كل واحد.
يجب وضع شريط المحاذاة على ملحق المحاذاة. يجب وضع لوحة خلفية زجاجية أعلى الفاصل. ثم نعلق المشابك المعدنية على غرف التدفق.
استخدم المقص لتقليم نهايات فواصل غرفة التدفق. ضع غرفة التدفق مع المصفوفة الدقيقة في رف الغرفة. ماصة 150 ميكرولتر من RA1.
احتضان لمدة 30 دقيقة وكرر خمس مرات. ماصة 450 ميكرولتر من XC1 ، وتحضن لمدة 10 دقائق. ماصة 450 ميكرولتر من XC2 وتحضن لمدة 10 دقائق.
ماصة 200 ميكرولتر من TEM. حضانة لمدة 15 دقيقة. ماصة 450 ميكرولتر من 95 ٪ فورماميد.
احتضان لمدة دقيقة واحدة ، وتكرار مرتين. احتضان لمدة خمس دقائق. ماصة 450 ميكرولتر من XC3.
احتضان لمدة دقيقة واحدة وتكرار. في هذه الخطوة ، سيتم توزيع الكواشف التالية ، 250 ميكرولتر من STM ، و 450 ميكرولتر من XC3 ، و 250 ميكرولتر من أجهزة الصراف الآلي. قم بمخطط التكرار التالي.
بعد كل التكرار والحضانة ، ضع المصفوفات الدقيقة على رف دائم وقم بغمسها في حاوية الغسيل. التحرك ببطء وخفة مع حركات لأعلى ولأسفل ، 10 مرات. جفف المصفوفات الدقيقة باستخدام مجفف الفراغ لمدة 50 إلى 55 دقيقة.
بمجرد تجفيف المصفوفات الدقيقة ، انتقل إلى تصوير microarray باستخدام الفحص. في هذه الصورة ، يمكننا رؤية جميع البروتوكولات المستخدمة ، من اختيار المشاركين إلى معالجة ملفات IDAT التي تم الحصول عليها في اليوم الأخير من تجربة المثيلة. تم نقل الملفات إلى الكمبيوتر حيث تم إجراء التحليل المعلوماتي الحيوي.
تمت معالجة التحليل باستخدام R Studio وحزمة ChAMP للموصلات الحيوية. تأكد من أن لديك ما لا يقل عن ثمانية غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي على جهاز الكمبيوتر الخاص بك. تم إجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية الأخرى ، مثل إثراء الجينات لتقديم البيانات بشكل أفضل للقارئ.
في هذا الجدول ، يمكننا ملاحظة المجموعتين المستخدمتين في هذه الدراسة ، السمينة وغير البدينة. كان هناك فرق بين مجموعات المتغيرات ، ومؤشر كتلة الجسم ، ومحيط البطن ، وكتلة الدهون بالكيلوغرام ، وكتلة الدهون في المئة. من خلال مراقبة المخطط المقدم في هذا الشكل ، تمكنا من فهم أن البروتوكول المقترح كان كافيا لبياناتنا.
وبعد تحليل المعلوماتية الحيوية ، تم تقديم ما مجموعه 409،887 مسبارا بعد إجراء المرشح. كشفت مؤامرة الكثافة أن جميع العينات لها كثافات مماثلة لتوزيع بيتا. ولم تستبعد أي عينات بناء على هذه التحليلات.
كشف تحليل تحلل القيمة الفردية للبيانات العادية أن مؤشر كتلة الجسم و C المزدوج و FM أثر بشكل كبير على تباين بيانات مثيلة الحمض النووي. كشف تقدير نوع الخلية أن كلا من الخلايا القاتلة الطبيعية ، NK والخلايا البائية كانت أعلى في النساء البدينات. كانت مستويات مثيلة الحمض النووي بين النساء البدينات وغير البدينات مختلفة قبل وبعد تصحيح نوع الخلية.
قبل التصحيح ، لوحظ 43،463 موقف مثيلة مختلفة. وبعد ذلك ، بقي 3،329 CPG بشكل كبير. وكان ما مجموعه 162 من مركبات الكربون الكلورية فلورية من هيبوميثيلاتيد، و 576 من مركبات فرط الميثيل في البدناء مقارنة بغير البدينين.
والبيانات متاحة في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية تحت رمز التسجيل GSE166611. نقدم مواقع CPG التي ارتبطت بالخصائص المحددة للمشاركين التي لوحظت في SVD. بالنسبة لكتلة الدهون ، تم العثور على 13،222 موقعا CPG.
كان هناك 6،159 CPG ذات الصلة كتلة الدهون في منطقة المروج. 470 هيبوميثيل و 94 هايب ميثيلاتيد. تم إثراء الجينات المعنية من المواقع المرتبطة بها ويتم عرضها الآن.
لاحظنا أن البروتوكول المقترح قادر على تحديد أنماط المثيلة الخاصة بك ، ومن الصواب أن يرتبط داخل المثيلة الخاصة بك. تؤكد نتيجتنا أن نمط الحياة البدينة يمكن أن يعزز التغيرات اللاجينية في الحمض النووي البشري.
