Крупномасштабные омические технологии все чаще используются в исследованиях, посвященных ожирению. Эпигенетика может быть связующим звеном между воздействием и последствиями для здоровья. Этот тип исследования генерирует огромное количество данных.
Учитывая это, важно стандартизировать протоколы, чтобы сделать данные технически сопоставимыми. В этом исследовании мы собираемся предложить конвейер для получения и анализа данных метилирования ДНК. Один и тот же протокол может применяться как для 400K, так и для эпических версий.
День первый: Обработка бисульфитом. Начните с денатурации геномной ДНК, затем добавьте конверсионные реагенты. Необходимо следовать рекомендациям комплекта.
И обработать денатурирующую ДНК бисфосфатом. Затем инкубируют образцы в термоциклере. Выполните шаги стирки с помощью моечного буфера.
День второй: Амплификация после анализа метилирования, ручной протокол. Разогрейте печь гибридизации до 37 градусов по Цельсию и дайте температуре уравновеситься. Рассейте 20 микролитров MA1 в колодцы плиты.
Перенесите четыре микролитра ДНК в соответствующие лунки на пластине. Диспергировать четыре микролитра раствора гидроксида натрия в пластинчатые колодцы. Запечатайте пластину пластиковым уплотнением.
Вихрь пластины, чтобы смешать реагенты с образцами. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Рассеять 68 микролитров об/мин в каждую лунку, а затем 75 микролитров МСМ, не удаляя предварительно раствор.
Используйте новое уплотнение для покрытия пластины. Вихрь тарелки в течение одной минуты. Инкубировать в гибридизационной печи в течение 20-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.
День третий: Гибридизация после анализа метилирования, ручной протокол. Разогрейте блок, вставив пластину при 37 градусах Цельсия. Осторожно снимите пластину с печи гибридизации.
Импульсная центрифуга пластины. Снимите уплотнение с пластины. Добавьте 50 микролитров FMS в каждый контейнер для образцов.
Вихрь тарелки в течение одной минуты. Центрифуга необходима пластине. Затем поместите герметичную пластину на нагревательный блок при температуре 37 градусов Цельсия на один час.
Добавьте 100 микролитров PM1 в каждую скважину, содержащую образцы. Снова запечатайте пластину. Вихрь тарелки в течение одной минуты.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем пульсируйте в центрифуге в течение одной минуты, затем добавляйте 300 микролитров 100%2-пропанола в каждую лунку с образцом. Снова запечатайте пластину.
Перемешайте все содержимое, перевернув пластину не менее 10 раз. Инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, а затем центрифугируйте при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Снимите уплотнение с пластины.
Быстро переверните пластину в соответствующее место, выбросив супернатант. Нажмите несколько раз, пока не заметите, что все колодцы свободны от жидкости. При комнатной температуре оставьте тарелку перевернутой и непокрытой на один час.
После высыхания всей жидкости необходимо увидеть синие поддоны на дне колодцев. Затем добавьте 46 микролитров RA1 в каждую лунку. Нанесите тепловое уплотнение на пластину.
Держитесь плотно, чтобы выполнить герметизацию равномерно. Поставьте тарелку в печь гибридизации при 48 градусах Цельсия на один час, затем вихрь в течение одной минуты. Пульсируйте в центрифуге и нагревайте пластину при 95 градусах Цельсия в течение одного часа.
Подготовьте бисерные чипы Hyb Chambers вместе. На следующем этапе рассейте 400 микролитров ПБ2 в резервуарах в Камерах Hyb. После заполнения резервуаров Hyb Chamber ПБ2 немедленно накройте крышку.
Осторожно загрузите каждый образец с пластины в пробный вход микрочипа. Загрузите вставки Hyb-камеры, содержащие микрочипы, в Hyb-камеру. Закройте камеру Hyb поперечно, чтобы избежать возможного смещения Hyb-камеры.
День четвертый: Окрашивание после анализа метилирования, ручной протокол. После ночной инкубации извлеките все микрочипы из вкладышей. И мойте микрочипы медленно и легко, в общей сложности 10 раз, вверх и вниз.
Переместите микрочипы в контейнер PB1 номер два и повторите 10 раз, вверх и вниз. Поместите рамки flow chamber в правильное положение, а затем каждый микрочип. Используйте прозрачную распорку в верхней части каждого из них.
Планка выравнивания должна быть расположена на аксессуаре выравнивания. Стеклянная задняя пластина должна быть размещена поверх распорки. Затем прикрепите металлические зажимы к проточным камерам.
Используйте ножницы, чтобы обрезать концы проставок Flow Chamber. Поместите проточную камеру с микрочипом в стойку камеры. Пипетка 150 микролитров RA1.
Инкубировать в течение 30 минут и повторить пять раз. Пипетка 450 микролитров XC1, и инкубировать в течение 10 минут. Пипетка 450 микролитров XC2 и инкубируется в течение 10 минут.
Пипетка 200 микролитров ТЭМ. Инкубировать в течение 15 минут. Пипетка 450 микролитров 95% формамида.
Инкубировать в течение одной минуты, повторяя дважды. Инкубировать в течение пяти минут. Пипетка 450 микролитров XC3.
Инкубировать в течение одной минуты и повторить. На этом этапе будут дозироваться следующие реагенты: 250 микролитров STM, 450 микролитров XC3 и 250 микролитров ATM. Выполните следующую схему повторения.
После всех повторов и инкубаций поместите микрочипы на стоячую стойку и окуните их в емкость для мойки. Двигаясь медленно и легко с движениями вверх и вниз, 10 раз. Высушите микрочипы с помощью вакуумного осушителя в течение 50-55 минут.
После того, как микрочипы высохнут, приступайте к изображению микрочипа с помощью сканирования. На этом изображении мы можем увидеть все используемые протоколы, от выбора участников до обработки файлов IDAT, полученных в последний день эксперимента по метилированию. Файлы были перенесены на компьютер, где проводился биоинформационный анализ.
Анализ обрабатывался с использованием R Studio и пакета Bioconductor ChAMP. Убедитесь, что на вашем компьютере есть не менее восьми гигабайт оперативной памяти. Другие биоинформационные анализы, такие как обогащение генов, были выполнены, чтобы лучше представить данные читателю.
В этой таблице мы можем наблюдать две группы, используемые в этом исследовании, тучные и не страдающие ожирением. Существовала разница между группами по переменным, индексу массы тела, окружности живота, жировой массе в килограммах и жировой массе в процентах. Наблюдая за схемой, представленной на этом рисунке, мы смогли понять, что предложенный протокол был адекватен нашим данным.
А после биоинформационного анализа после выполнения фильтра было представлено в общей сложности 409 887 зондов. График плотности показал, что все образцы имели одинаковую плотность бета-распределения. На основе этих анализов не было исключено ни одного образца.
Анализ сингулярного разложения значений нормализованных данных показал, что ИМТ, двойной C и FM значительно влияют на изменчивость данных метилирования ДНК. Оценка типа клеток показала, что как естественные клетки-киллеры, NK, так и В-клетки были выше у женщин с ожирением. Уровни метилирования ДНК между женщинами с ожирением и женщинами, не страдающими ожирением, были разными до и после коррекции типа клеток.
До коррекции наблюдалось 43 463 различных положения метилирования. И после этого 3 329 CPG остались значительными. В общей сложности 162 CPG были гипометилированы, а 576 были гиперметилированы при ожирении по сравнению с отсутствием ожирения.
Данные доступны в базе данных GEO под регистрационным кодом GSE166611. Мы представляем сайты CPG, которые были связаны со специфическими характеристиками участников, которые наблюдались при СВД. Для жировой массы было обнаружено 13 222 участка CPG.
В промоторном регионе было 6 159 CPG, связанных с жировой массой. 470 гипометилированных и 94 гиперметилированных. Соответствующие гены ассоциированных участков были обогащены и теперь показаны.
Мы заметили, что предлагаемый протокол способен идентифицировать ваши паттерны метилирования, и это правильно, чтобы соотнести с вашими метилациями. Наш результат подтверждает, что обесогенный образ жизни может способствовать эпигенетическим изменениям в ДНК человека.
