טכנולוגיות omics בקנה מידה גדול נמצאים בשימוש יותר ויותר במחקרים המתמקדים השמנת יתר. אפיגנטיקה יכולה להיות קשר בין החשיפה לתוצאות הבריאותיות. סוג זה של מחקר מייצר כמות עצומה של נתונים.
בהתחשב בכך, חשוב לתקנן את הפרוטוקולים כדי להפוך את הנתונים לדומים מבחינה טכנית. במחקר זה, אנחנו הולכים להציע צינור על מנת להשיג ולנתח נתוני מתילציה DNA. ניתן להחיל את אותו פרוטוקול הן עבור 400K והן עבור גירסאות אפיות.
היום הראשון: טיפול ביסולפיט. התחל על ידי denaturing DNA גנומי, ולאחר מכן להוסיף את ריאגנטים ההמרה. יש צורך לעקוב אחר ההמלצות של הערכה.
ותטפל בדנ"א המדכא עם ביספוספט. ואז לדגור על הדגימות במחזור תרמי. בצע את שלבי הכביסה באמצעות מאגר הכביסה.
יום שני: הגברה בעקבות בדיקת המתילציה, פרוטוקול ידני. מחממים את תנור ההיברידיות ב-37 מעלות ומניחים לטמפרטורה להשתוות. לפזר 20 מיקרוליטרים של MA1 לתוך הבארות של הצלחת.
העבר ארבעה מיקרוליטרים של ה- DNA לבארות המתאימות על הצלחת. לפזר ארבעה microliters של פתרון נתרן הידרוקסיד לתוך בארות הצלחת. לאטום את הצלחת עם חותם פלסטיק.
מערבולת את הצלחת כדי לערבב את הריאגנטים עם דוגמאות. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. פזרו 68 מיקרוליטרים של סל"ד לתוך כל באר, ולאחר מכן 75 מיקרוליטרים של MSM מבלי להסיר את הפתרון הקודם.
השתמש בחותם חדש כדי לכסות את הצלחת. מערבולת את הצלחת לדקה אחת. דגירה בתנור הכלאה במשך 20 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
יום שלישי: הכלאה בעקבות בדיקת מתילציה, פרוטוקול ידני. מחממים את הבלוק על ידי החדרת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס. מוציאים בזהירות את הצלחת מתנור ההיברידיות.
צנטריפוגת דופק את הצלחת. מוציאים את החותם מהצלחת. הוסף 50 מיקרוליטרים של FMS לכל מיכל מדגם.
מערבולת את הצלחת לדקה אחת. צנטריפוגה הצלחת צריכה. לאחר מכן מניחים את הצלחת האטומה על בלוק החימום ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
הוסף 100 מיקרוליטרים של PM1 לכל באר המכילה דוגמאות. לאטום את הצלחת שוב. מערבולת את הצלחת לדקה אחת.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן דופק בצנטריפוגה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטרים של 100% 2-propanol לכל באר עם מדגם. לאטום את הצלחת שוב.
מערבבים את כל התוכן על ידי היפוך הצלחת לפחות 10 פעמים. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. מוציאים את החותם מהצלחת.
הפוך במהירות את הצלחת במקום מתאים, השלכת supernatant. הקש בחוזקה מספר פעמים עד שתבחין שכל הבארות נקיות מנוזלים. בטמפרטורת החדר, להשאיר את הצלחת הפוכה וחשופה במשך שעה אחת.
לאחר ייבוש כל הנוזל, יש צורך לראות משטחים כחולים בתחתית הבארות. לאחר מכן הוסיפו 46 מיקרוליטרים של RA1 לכל באר. החל את חותם החום על הצלחת.
החזק חזק כדי לבצע את האיטום באופן שווה. שים את הצלחת בתנור הכלאה ב 48 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, ולאחר מכן מערבולת במשך דקה אחת. דופקים בצנטריפוגה, ומחממים את הצלחת ב-95 מעלות צלזיוס למשך שעה.
הכינו את צ'יפ הייב צ'יימברס החרוזים ביחד. בשלב הבא, לפזר 400 microliters של PB2 לתוך המאגרים בתאי Hyb. לאחר מילוי מאגרי Hyb Chamber עם PB2, לשים את המכסה על מיד.
טען בזהירות כל דגימה מהצלחת לערך המדגם של המיקרו-ארי. טען את התוספות של חדר Hyb המכילות את המיקרו-אריות לתוך חדר Hyb. סגור את חדר Hyb חוצה כדי למנוע הסטה אפשרית של חדר Hyb.
יום רביעי: מכתים בעקבות בדיקת המתילציה, פרוטוקול ידני. לאחר הדגירה הלילית, להסיר את כל microarrays מן התוספות. ולשטוף את המיקרו-ערים לאט ובקלילות, בסך הכל 10 פעמים, למעלה ולמטה.
העבר את המיקרו-אריות למיכל PB1 מספר שתיים וחזור על הפעולה 10 פעמים, למעלה ולמטה. מקם את המסגרות של תא הזרימה במצב הנכון ולאחר מכן כל microarray. השתמש במרווח שקוף בחלק העליון של כל אחד מהם.
יש למקם את סרגל היישור על אביזר היישור. צלחת אחורית מזכוכית צריכה להיות מונחת על גבי המרווח. לאחר מכן חבר מהדקי מתכת לתאי הזרימה.
השתמש במספריים כדי לקצץ את הקצוות של מרווחי תא הזרימה. מניחים את תא הזרימה עם המיקרו-אריה לתוך מתלה התא. פיפטה 150 מיקרוליטרים של RA1.
יש לדגור במשך 30 דקות ולחזור על הפעולה חמש פעמים. פיפטה 450 מיקרוליטרים של XC1, ודגרה במשך 10 דקות. פיפטה 450 מיקרוליטרים של XC2 ודגרה במשך 10 דקות.
פיפטה 200 מיקרוליטרים של TEM. דגירה במשך 15 דקות. פיפטה 450 מיקרוליטרים של 95% פורממיד.
דגירה לדקה אחת, חוזרת פעמיים. דגירה לחמש דקות. פיפטה 450 מיקרוליטרים של XC3.
דגירה לדקה אחת וחוזר חלילה. בשלב זה, הריאגנטים הבאים יחולקו, 250 מיקרוליטרים של STM, 450 מיקרוליטרים של XC3, ו 250 מיקרוליטרים של כספומט. בצע את ערכת החזרות הבאה.
לאחר כל החזרות והדגירה, מניחים את המיקרו-ערים על מתלה עומד וטובלים אותם במיכל הכביסה. נע לאט ובקלות עם תנועות למעלה ולמטה, 10 פעמים. יבש את microarrays באמצעות ייבוש ואקום במשך 50 עד 55 דקות.
לאחר שהמיקרו-אריות יתייבשו, המשיכו לדמות את המיקרו-ערים עם הסריקה. בתמונה זו, אנו יכולים לראות את כל הפרוטוקולים המשמשים, מבחירת המשתתפים לעיבוד קבצי IDAT שהושגו ביום האחרון של ניסוי המתילציה. הקבצים הועברו למחשב שבו בוצע הניתוח הביו-אינפורמטי.
הניתוח עובד באמצעות R Studio וחבילת ChAMP של מוליכים ביולוגיים. ודא שיש לך לפחות שמונה ג'יגה-בתים של זיכרון RAM במחשב. ניתוחים ביואינפורמטיים אחרים, כגון העשרת גנים, בוצעו כדי להציג טוב יותר את הנתונים לקורא.
בטבלה זו, אנו יכולים לראות את שתי הקבוצות המשמשות במחקר זה, השמנת יתר ולא שמנים. היה הבדל בין קבוצות למשתנים, מדד מסת הגוף, היקף הבטן, מסת שומן בקילוגרם ומסת שומן באחוזים. בהתבוננות בתכנית המוצגת בנתון זה, הצלחנו להבין כי הפרוטוקול המוצע היה מתאים לנתונים שלנו.
ולאחר הניתוח הביו-אינפורמטי, סך הכל 409, 887 בדיקות הוצגו לאחר ביצוע המסנן. עלילת הצפיפות גילתה שלכל הדגימות היו צפיפות דומה של התפלגות בטא. לא נכללו דגימות על סמך ניתוח זה.
ניתוח פירוק הערך הייחודי של הנתונים המנורמלים גילה כי BMI, כפול C ו- FM השפיעו באופן משמעותי על השתנות נתוני המתילציה של ה- DNA. הערכת סוג התא גילתה כי שני תאי הרוצח הטבעיים, תאי NK ו- B היו גבוהים יותר אצל נשים שמנות. רמות מתילציה DNA בין נשים שמנות ולא שמנות היו שונות לפני ואחרי תיקון סוג התא.
לפני התיקון נצפו 43, 463 עמדות מתילציה שונות. ואחרי זה, 3, 329 CPGs נשאר באופן משמעותי. בסך הכל 162 CPGs היו hypomethylated, ו 576 היו hypermethylated בהשמנת יתר לעומת לא שמנים.
הנתונים זמינים במסד הנתונים GEO תחת קוד הרישום GSE166611. אנו מציגים את אתרי CPG שהיו קשורים למאפיינים הספציפיים של המשתתפים שנצפו ב- SVD. עבור מסת שומן, 13, 222 אתרי CPG נמצאו.
היו 6, 159 שומן המוני הקשורים CPGs באזור האמרגן. 470 היפומתילציה ו-94 היפרמתילציה. הגנים המתאימים של האתרים הקשורים הועשרו וכעת מוצגים.
ראינו שהפרוטוקול המוצע מסוגל לזהות בתוך דפוסי המתילציות שלך, וזה נכון להתייחס בתוך המתילציות שלך. התוצאה שלנו מאשרת כי אורח חיים שמנים יכול לקדם שינויים אפיגנטיים בדנ"א האנושי.
