ويهدف البروتوكول إلى تطبيع جمع الوسط المستزرع وتحليل الصيغة الصبغية الكروموسومية على أساس فحص الكروموسومات غير الغازية NICS للأجنة البشرية قبل الزرع. الميزة الرئيسية لنظام NICS هي سهولة التشغيل بدلا من التلاعب الدقيق TiDieR ، وتوفير الوقت ، ويقلل بشكل فعال من فقدان عينة الخزعة الغازية. طريقة أخذ العينات مرنة للغاية.
نقدم لك هنا خيارين مختلفين ، أحدهما لزراعة الأجنة المتسلسلة الروتينية ، والآخر لخطوة واحدة. هؤلاء هم الزملاء الرئيسيون لفريقنا ، الدكتور Yaxin Yao والدكتور Xiaohui Zhu مسؤولون بشكل رئيسي عن إعداد المكتبة وتسلسل تجديد NICS. أنا والدكتور جيالين جيا نكمل عمل علم الأجنة وجمع العينات.
البروفيسور ليو هو قائد مجموعتنا. وهي أيضا المؤلفة المقابلة لهذا المقال. للبدء ، قم بإعداد الكواشف والأدوات.
قم بتسخين وتوازن 20 إلى 30 ميكرولتر من وسط الاستزراع والهيالورونيداز قبل الاستخدام. ثم ضع وسط الاستزراع والهيالورونيداز على سطح العمل في غطاء الدخان. انقل OCCCs المهضومة بسرعة في طبق الاستزراع للتعامل مع البويضات وقم بتغطيتها بالزيت المعدني في كل بئر.
قم بشفط البويضات برفق وحررها من خمس إلى 10 مرات لإزالة الخلايا الحبيبية المتبقية حول البويضات. كرر هذه الخطوة في الآبار الثلاثة المتبقية لإزالة الخلايا الحبيبية تماما. تقييم اكتمال إزالة الخلايا الحبيبية باستخدام المجهر.
ثم قم بإجراء حقن المنوية داخل الهيولى ، وتسمى أيضا الحقن المجهري ونقل الجنين إلى وسط الثقافة. تحضير 20 إلى 30 ميكرولتر من قطرات ميكرويرات متوسطة لزراعة الكيسة الأريمية لكل جنين. قم بتغطية الأجنة بالزيت المعدني في طبق زراعة الأنسجة في اليوم الثاني واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 5٪ أكسجين.
بعد نقل جنين اليوم الثالث إلى القطرة الدقيقة للغسيل ، قم بشفط الجنين برفق وحرره في القطيرة الدقيقة في القطرات الثلاث بشكل متسلسل باستخدام الماصات. ثم نقل الجنين إلى وسط زراعة الكيسة الأريمية. تحضير قطرات الغسيل الدقيقة والقطرات الدقيقة للثقافة.
بعد ظهر اليوم الرابع ، انقل الجنين إلى قطرات دقيقة تم تسخينها مسبقا من وسط الاستزراع واغسل كل جنين برفق بشكل متسلسل في ثلاث قطرات صغيرة باستخدام الماصات. نقل كل جنين إلى قطرة صغيرة واحدة فريدة من نوعها تم تسخينها مسبقا من وسط الاستزراع لجمع العينات. استزرع جنين الكيسة الأريمية قبل الحفظ بالتبريد.
لإجراء التزجيج قبل حفظ الجنين بالتبريد ، قم بإعداد القطرات الدقيقة المستنبتة ونقل الجنين إلى قطرات دقيقة تم تسخينها مسبقا من 10 إلى 15 ميكرولتر وسط استزراع. واغسل كل جنين برفق بشكل متسلسل في ثلاث قطرات دقيقة عن طريق سحب القطرات في صباح اليوم الخامس. كما هو موضح سابقا ، انقل كل جنين إلى قطرة صغيرة واحدة فريدة من نوعها تم تسخينها مسبقا من وسط المزرعة لجمع العينات.
وزرع جنين الكيسة الأريمية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل الحفظ بالتبريد. بعد ذلك ، اضبط ICM برفق على مسافة كبيرة من النقطة المستهدفة لشعاع الليزر الذي يركز على تقاطع الخلايا في الأديم الظاهر لتوليد ثقب صغير في الأديم الظاهر لإطلاق السائل من تجويف الأريم. لجمع العينة ، قم بإذابة المخزن المؤقت في المجموعة في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
ثم انقل وسط المزرعة من كل جنين مزروع إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الخالي من RNase-DNase الذي يحتوي على خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحلل الخلية. تحضير الكواشف والأدوات. بعد تحديد كمية الحمض النووي الجينومي المخفف إلى تركيز 50 بيكوغرام لكل ميكرولتر باستخدام وسط الاستزراع.
بعد الخلط جيدا ، قم بطرد الأنبوب لفترة وجيزة عند 200 جرام لمدة خمس ثوان. بعد الطرد المركزي لوسط الاستزراع في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 30 إلى 60 ثانية ، فإن ماصة 10 ميكرولتر من وسط الاستزراع من قاع الأنبوب تخفف من التحكم الإيجابي ووسط الثقافة الطازج إلى أنبوب PCR جديد 0.2 ملليلتر. أضف ميكرولتر واحد من مزيج إنزيم MT واخلطه جيدا عن طريق الماصة.
ثم أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. ضع أنبوب PCR في محطة تحضير عينة مختلطة مسخنة مسبقا وقم بتشغيل برنامج التحلل. بمجرد إذابة المخزن المؤقت قبل lib وخلطه ، قم بطرده على الفور لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 200 G.قم بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل ما قبل المكتبة عن طريق إضافة ميكرولتر من مزيج إنزيم ما قبل المكتبة إلى 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت قبل المكتبة.
خلط رد الفعل جيدا وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. أضف 60 ميكرولترا من مزيج تفاعل ما قبل المكتبة إلى العينة المتوسطة المعالجة مسبقا. بعد مزجه جيدا عن طريق السحب ، قم بأجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 200 G.ضع أنبوب PCR في محطة تحضير العينات المسخنة مسبقا.
قم بتشغيل برنامج ما قبل المكتبة مع الاستمرار عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل المكتبة عن طريق إضافة 1.6 ميكرولتر من مزيج إنزيمات المكتبة إلى 60 ميكرولترا من المخزن المؤقت للمكتبة. امزج التفاعل جيدا وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.
أضف 60 ميكرولترا من مزيج تفاعل المكتبة واثنين ميكرولتر من برايمر الباركود لكل منتج ما قبل المكتبة. ثم خلط التفاعل جيدا وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح. بعد الطرد المركزي ، ضع أنبوب PCR في الدورة الحرارية.
قم بتشغيل برنامج إعداد المكتبة ثم استمر عند أربع درجات مئوية. تحضير الكواشف والأدوات. أضف حبات 1X الضخمة المعدة إلى عينة المكتبة.
حدد المكتبات المنقاة كما هو موضح في المخطوطة النصية واستخدم 10 نانوجرام من كل عينة مكتبة للتجميع. ارجع إلى دليل مستخدم التسلسل وقم بإجراء تحليل البيانات بعد اكتمال التسلسل. أدخل اسم المستخدم وكلمة المرور في صفحة تسجيل الدخول لتحليل البيانات في ChromGo.
بمجرد تسجيل الدخول ، انقر فوق إنشاء إرسال تحت علامة التبويب NICS. ثم اختر NGS للمنصة ، و Illumina للشركة ، و NICSInst للكاشف. أدخل معلومات المشروع في المربع ضمن معرف المشروع.قم بتعيين تفضيلات التحليل وتحميل الملفات.
بمجرد تحميل جميع ملفات التسلسل بنجاح، انقر فوق إرسال لبدء التحليل. يتم سرد المشاريع المقدمة ضمن علامة التبويب عرض التقديمات. انقر فوق الزر إظهار في حقل التقرير لعرض الجدول الموجز لتحليل NICS.
انقر فوق الزر تصدير التقرير لحفظ التقارير. تم الحصول على ستة أكياس أريمية من المرضى وتم إجراء NICS على جميع الأجنة الستة من اليوم الرابع إلى اليوم الخامس المتوسط. تم الكشف عن تشوهات الكروموسومات الناجمة عن النقل المتوازن للوالدين في خمسة من الكروموسومات باستخدام اختبار NICS وبالتالي ، لم يتم استخدامها للنقل.
أظهرت نتائج NICS للجنينين أن نفس النمط النووي 45 XN وحذف الكروموسوم 18 كلاهما حذف الكروموسوم 18. كان الذراع القصير للنمط النووي 46 XN للكروموسوم حذف منطقة واحدة فقط الذراع القصير لحذف منطقة الكروموسوم. أظهرت نتائج NICS النمط النووي 46 XN مع حذف الذراع الطويل للكروموسوم 18 المنطقة والذراع القصير للكروموسوم منطقة واحدة مزدوجة.
على الرغم من أن الأنماط النووية كانت عبارة عن نسخ من الكروموسومات الخمسة وأظهرت ثمانية اختلافات في الفسيفساء ، إلا أن اختبار NICS يمكن أن يفحص جميع الكروموسومات ال 24 بحثا عن اختلال الصيغة الصبغية. توفر هذه العملية طريقة جديدة لنقل الكيسات الأريمية ذات النمط النووي الطبيعي المفرد. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إزالة الخلايا التراكمية تماما لتجنب تلوث أصل الأم وجمع وسط المزرعة ومرحلة الكيسة الأريمية الموضحة عندما يكون محتوى الحمض النووي كافيا للتضخيم.
وباستخدام تكنولوجيا نظام NICS، قامت هذه الدراسة بتبسيط خطوات إعداد مكتبة WGA وWGS في حوالي ثلاث ساعات واختيار نتيجة CCS بشكل غير جراحي في حوالي تسع ساعات. بعد تطويرها ، قدمت هذه التقنية للطبيب في العلاج المضاد للفيروسات القهقرية طريقة جديدة للجمع بين التقييم المورفولوجي و NICS لنقل الجنين الصبغي مع مورفولوجيا جيدة إلى الرحم قد يحسن معدلات الحمل المستمرة ومعدلات المواليد الأحياء.
