O protocolo consiste em normalizar a coleta do meio de cultura e a análise da ploidia cromossômica com base na triagem cromossômica não invasiva da NICS de embriões humanos pré-implantação. A principal vantagem do NICS é a facilidade de operação em vez da micromanipulação do TiDieR, economizando tempo e reduzindo efetivamente a perda de amostra de biópsia invasiva. O método de amostragem é muito flexível.
Aqui oferecemos duas opções diferentes, uma para cultura sequencial de embriões de rotina e outra para uma etapa. Estes são os principais colegas de nossa equipe, Dr.Yaxin Yao e Dr.Xiaohui Zhu são os principais responsáveis pela preparação da biblioteca e pelo sequenciamento de regeneração do NICS. Dr.Jialin Jia e eu completamos o trabalho de embriologia e coleta de amostras.
O professor Liu é o líder do nosso grupo. Ela também é a autora correspondente deste artigo. Para começar, prepare os reagentes e ferramentas.
Pré-aquecer e equilibrar 20 a 30 microlitros de meio de cultura e hialuronidase antes do uso. Em seguida, coloque o meio de cultura e a hialuronidase em uma superfície de trabalho em um exaustor. Transfira rapidamente os CCOCs digeridos na placa de cultura para manuseio de ovócitos e cubra com óleo mineral em cada poço.
Aspirar suavemente e liberar os ovócitos cinco a 10 vezes para remover as células residuais da granulosa ao redor dos ovócitos. Repita este passo nos três poços restantes para remover completamente as células da granulosa. Avaliar a completude da remoção de células da granulosa utilizando um microscópio.
Em seguida, realizar a injeção intracitoplasmática de espermatozoides, também chamada de ICSI e transferir o embrião para o meio de cultura. Preparar de 20 a 30 microlitros de microgotículas do meio de cultura de blastocisto para cada embrião. Cubra os embriões com óleo mineral em uma placa de cultura de tecidos no segundo dia e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio.
Depois de transferir o embrião do terceiro dia para a microgota de lavagem, aspirar suavemente e liberar o embrião na microgota nas três gotículas em série usando as pipetas. Em seguida, transferir o embrião para o meio de cultura de blastocisto. Prepare as microgotículas de lavagem e as microgotículas de cultura.
Na tarde do quarto dia, transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas de meio de cultura e lavar suavemente cada embrião em série em três microgotículas com as pipetas. Transfira cada embrião para uma única microgota pré-aquecida de meio de cultura para coleta de amostras. Cultura do embrião blastocisto antes da criopreservação.
Para a realização da vitrificação antes da criopreservação do embrião, preparar as microgotículas de cultura e transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas de 10 a 15 microlitros de meio de cultura. E lave suavemente cada embrião em série em três microgotículas por pipetagem na manhã do quinto dia. Como demonstrado anteriormente, transfira cada embrião para uma única microgota pré-aquecida de meio de cultura para coleta de amostras.
E cultivar o embrião blastocisto a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes da criopreservação. Em seguida, ajuste suavemente o MCI a uma distância considerável do ponto alvo do feixe de laser que se concentra na junção celular do trofectoderma para gerar um pequeno orifício no trofectoderma para liberar o fluido da cavidade do blastocoel. Para coletar a amostra, descongele o tampão do kit à temperatura ambiente e centrifugue brevemente.
Em seguida, transferir o meio de cultura de cada embrião cultivado para um tubo de PCR livre de RNase-DNase contendo cinco microlitros do tampão de lise celular. Preparar os reagentes e ferramentas. Após quantificação do DNA genômico diluído a uma concentração de 50 picogramas por microlitro com o meio de cultura.
Depois de misturar completamente, centrifugar o tubo brevemente a 200 G por cinco segundos. Após centrifugação do meio de cultura em microcentrífuga por 30 a 60 segundos, pipetar 10 microlitros de meio de cultura do fundo do tubo diluiu o controle positivo e o meio de cultura fresco para um novo tubo de PCR de 0,2 mililitros. Adicione um microlitro de mistura de enzimas MT e misture bem por pipetagem.
Em seguida, centrifugar imediatamente por dois a três segundos. Coloque o tubo de PCR em uma estação de preparação de amostra mista pré-aquecida e execute o programa de lise. Uma vez que o buffer pré-lib é descongelado e misturado, centrifuga-o imediatamente por dois a três segundos a 200 G.Prepare uma mistura mestre para a reação pré-biblioteca adicionando dois microlitros de mistura enzimática pré-biblioteca a 60 microlitros de buffer pré-biblioteca.
Misture bem a reação e centrifugue brevemente. Adicionar 60 microlitros de mistura de reação pré-biblioteca na amostra de meio pré-tratado. Depois de misturá-lo completamente por pipetagem, centrifugar imediatamente por dois a três segundos a 200 G.Coloque o tubo de PCR na estação de preparação de amostras pré-aquecidas.
Execute o programa de pré-biblioteca e segure a quatro graus Celsius. Prepare uma mistura mestre para a reação da biblioteca adicionando 1,6 microlitros de mistura enzimática da biblioteca a 60 microlitros de buffer da biblioteca. Misture bem a reação e centrifuja como demonstrado anteriormente.
Adicione 60 microlitros da mistura de reação da biblioteca e dois microlitros do primer de código de barras a cada produto pré-biblioteca. Em seguida, misture bem a reação e centrifuja como demonstrado. Após a centrifugação, colocar o tubo de PCR no termociclador.
Execute o programa de preparação da biblioteca e, em seguida, segure a quatro graus Celsius. Preparar os reagentes e ferramentas. Adicione as mega contas preparadas 1X à amostra da biblioteca.
Quantifique as bibliotecas purificadas conforme descrito no manuscrito de texto e use 10 nanogramas de cada amostra de biblioteca para agrupamento. Consulte o guia do usuário de sequenciamento e execute a análise de dados após a conclusão do sequenciamento. Digite o nome e a senha do usuário na página de login para análise de dados no ChromGo.
Uma vez conectado, clique em Criar envio na guia NICS. Em seguida, escolha NGS para a plataforma, Illumina para corporação e NICSInst para o reagente. Insira as informações do projeto na caixa em ID do projeto.Defina as preferências de análise e carregue os arquivos.
Depois que todos os arquivos de sequenciamento forem carregados com êxito, clique em Enviar para iniciar a análise. Os projetos enviados estão listados na guia Exibir envios. Clique no botão Mostrar no campo Relatório para exibir a tabela de resumo da análise NICS.
Clique no botão Exportar Relatório para salvar os relatórios. Seis blastocistos foram obtidos das pacientes e a NICS foi realizada em todos os seis embriões do quarto ao quinto dia do meio. As anormalidades cromossômicas causadas pela translocação balanceada dos pais foram detectadas em cinco cromossomos pelo ensaio NICS e, portanto, não foram utilizadas para transferência.
Os resultados da NICS dos dois embriões mostraram o mesmo cariótipo 45 XN e a deleção do cromossomo 18 foram ambas deleções do cromossomo 18. O braço curto do cariótipo 46 XN da deleção da região cromossômica um foi apenas o braço curto da deleção da região cromossômica. Os resultados da NICS mostraram cariótipo 46 XN com o braço longo da deleção da região do cromossomo 18 e o braço curto da região do cromossomo um.
Embora os cariótipos fossem duplicações do cromossomo cinco e mostrassem oito diferenças em mosaico, o ensaio NICS foi capaz de rastrear todos os 24 cromossomos para aneuploidia. Este processo fornece um novo método para a transferência de blastocistos de cariótipo normal único. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de remover completamente as células cumulares para evitar a contaminação de origem materna e coletar o meio de cultura e o estágio de blastocisto exposto, quando o conteúdo de DNA é suficiente para amplificação.
Utilizando a tecnologia NICS, o presente estudo simplificou as etapas de preparação do WGA e da biblioteca do WGS em cerca de três horas e optou pelo resultado do CCS de forma não invasiva em cerca de nove horas. Após seu desenvolvimento, a técnica forneceu ao clínico em TARV uma nova maneira de combinar avaliação morfológica com NICS para transferir embriões aploidias com boa morfologia para o útero que poderiam melhorar as taxas de gravidez e de nascidos vivos em andamento.
