프로토콜은 인간 착상 전 배아의 비침습적 염색체 스크리닝 NICS를 기반으로 배양된 배지 수집 및 염색체 다공체 분석을 정상화하는 것입니다. NICS의 주요 장점은 TiDieR 미세 조작보다 작동이 쉽고 시간이 절약되며 침습적 생검 샘플 손실을 효과적으로 줄인다는 것입니다. 샘플링 방법은 매우 유연합니다.
여기서는 두 가지 옵션을 제공하는데, 하나는 일상적인 순차 배아 배양을 위한 것이고 다른 하나는 한 단계를 위한 것입니다. 이들은 우리 팀의 주요 동료이며, Yaxin Yao 박사와 Xiaohui Zhu 박사는 주로 라이브러리 준비 및 NICS 재생 시퀀싱을 담당합니다. Dr.Jialin Jia와 저는 발생학 연구와 샘플 수집을 완료했습니다.
Liu 교수는 우리 그룹의 리더입니다. 그녀는 이 기사의 교신 저자이기도 합니다. 시작하려면 시약과 도구를 준비하십시오.
사용하기 전에 20-30 마이크로리터의 배양 배지와 히알루로니다아제를 예열하고 평형을 이룹니다. 그런 다음 배양 배지와 히알루로니다아제를 흄 후드의 작업 표면에 놓습니다. 난모세포 처리를 위해 배양 접시에서 소화된 OCCC를 빠르게 옮기고 각 웰에 미네랄 오일을 덮습니다.
부드럽게 흡인했다가 난모세포를 5-10회 방출하여 난모세포 주변에 남아 있는 과립세포를 제거합니다. 나머지 3개의 웰에서 이 단계를 반복하여 과립 세포를 완전히 제거합니다. 현미경을 사용하여 과립 세포 제거의 완전성을 평가합니다.
그런 다음 ICSI라고도 하는 세포질 내 정자 주입을 수행하고 배아를 배양 배지로 옮깁니다. 각 배아에 대해 20-30 마이크로리터의 배반포 배양 배지 미세 방울을 준비합니다. 둘째 날에 조직 배양 접시에 배아를 미네랄 오일로 덮고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 산소 5%에서 배양합니다.
3일째 되는 배아를 세척 미세 방울에 옮긴 후, 피펫을 사용하여 3개의 물방울에 있는 미세 방울에서 배아를 부드럽게 흡인하고 방출합니다. 그런 다음 배아를 배반포 배양 배지로 옮깁니다. 세척 미세 방울과 배양 미세 방울을 준비합니다.
넷째 날 오후에 배아를 예열된 배양 배지의 미세방울에 옮기고 피펫으로 각 배아를 3개의 미세방울로 연속적으로 부드럽게 세척합니다. 샘플 수집을 위해 각 배아를 미리 따뜻해진 고유한 단일 미세방울의 배양 배지에 옮깁니다. 냉동 보존 전에 배반포 배아를 배양합니다.
배아 동결 보존 전에 유리화를 수행하기 위해, 배양 미세 방울을 준비하고 배아를 10 내지 15 마이크로 리터 배양 배지의 예열된 미세 방울로 옮깁니다. 그리고 5일째 되는 날 아침에 피펫팅을 통해 각 배아를 3개의 미세 방울로 연속적으로 부드럽게 세척합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 샘플 수집을 위해 각 배아를 미리 따뜻해진 고유한 단일 미세방울의 배양 배지로 옮깁니다.
그리고 냉동 보존 전에 섭씨 37도에서 배반포 배아를 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 다음으로, 영양배엽의 세포 접합부에 초점을 맞추는 레이저 빔의 표적 지점에서 상당한 거리에서 ICM을 부드럽게 조정하여 영양배엽에 작은 구멍을 생성하여 배반강에서 유체를 방출합니다. 샘플을 수집하려면 키트의 버퍼를 실온에서 해동하고 잠시 원심분리합니다.
그런 다음 배양된 각 배아의 배양 배지를 5마이크로리터의 세포 용해 완충액이 들어 있는 RNase-DNase-free PCR 튜브로 옮깁니다. 시약과 도구를 준비합니다. 게놈 DNA를 정량화한 후 배양 배지로 마이크로리터당 50피코그램의 농도로 희석하였다.
완전히 혼합한 후 튜브를 200G에서 5초 동안 잠시 원심분리합니다. 배양 배지를 마이크로 원심분리기에서 30 내지 60초 동안 원심분리한 후, 튜브 바닥에서 10 마이크로리터의 배양 배지를 피펫팅하여 양성 대조군 및 신선한 배양 배지를 새로운 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 희석하였다. MT 효소 혼합물 1마이크로리터를 넣고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.
그런 다음 즉시 2-3초 동안 원심분리합니다. PCR 튜브를 예열된 혼합 시료 전처리 스테이션에 넣고 용해 프로그램을 실행합니다. pre-lib 완충액이 해동되고 혼합되면, 200 G에서 2-3초 동안 즉시 원심분리합니다.60 microliter의 pre-library 완충액에 2 microliter의 pre-library 효소 혼합물을 첨가하여 pre-library 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다.
반응을 완전히 혼합하고 짧게 원심 분리하십시오. 60 마이크로리터의 사전 라이브러리 반응 혼합물을 전처리된 배지 샘플에 추가합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합한 후 즉시 200G에서 2-3초 동안 원심분리합니다.PCR 튜브를 예열된 시료 전처리 스테이션에 놓습니다.
사전 라이브러리 프로그램을 실행하고 섭씨 4도를 유지합니다. 1.6 마이크로리터의 라이브러리 효소 혼합물을 60 마이크로리터의 라이브러리 완충액에 첨가하여 라이브러리 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 반응을 완전히 혼합하고 이전에 설명한 대로 원심분리합니다.
라이브러리 반응 혼합물 60마이크로리터와 바코드 프라이머 2마이크로리터를 각 사전 라이브러리 제품에 추가합니다. 그런 다음 반응을 완전히 혼합하고 설명된대로 원심 분리하십시오. 원심분리 후 PCR 튜브를 열 순환기에 넣습니다.
라이브러리 준비 프로그램을 실행한 다음 섭씨 4도를 유지합니다. 시약과 도구를 준비합니다. 준비된 1X 준비된 메가 비드를 라이브러리 샘플에 추가합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 정제된 라이브러리를 정량화하고 풀링을 위해 각 라이브러리 샘플의 10나노그램을 사용합니다. sequencing 사용 가이드를 참고하여 sequencing이 완료된 후 데이터 분석을 수행합니다. ChromGo에서 데이터 분석을 위해 로그인 페이지에 사용자의 이름과 비밀번호를 입력합니다.
로그인한 후 NICS 탭에서 Create Submission(제출 생성)을 클릭합니다. 그런 다음 플랫폼(Platform)에 NGS, 기업(Corporation)에 대해 Illumina, 시약(Reagent)에 대해 NICSInst를 선택합니다. 프로젝트 ID(Project ID) 아래의 상자에 프로젝트 정보를 입력합니다.분석 기본 설정을 지정하고 파일을 업로드합니다.
모든 염기서열분석 파일이 성공적으로 업로드되면 제출을 클릭하여 분석을 시작합니다. 제출된 프로젝트는 제출물 보기 탭 아래에 나열됩니다. Report(보고서) 필드에서 Show(표시) 버튼을 클릭하여 NICS 분석의 요약 테이블을 봅니다.
Export Report(보고서 내보내기) 버튼을 클릭하여 보고서를 저장합니다. 환자로부터 6개의 배반포를 채취하고 4일째부터 5일째까지 6개의 배아 모두에 대해 NICS를 수행했습니다. 부모의 균형 전좌로 인한 염색체 이상은 NICS 분석을 사용하여 5개의 염색체에서 발견되었으므로 이식에 사용되지 않았습니다.
두 배아의 NICS 결과는 동일한 핵형 45 XN과 18번 염색체 결실이 모두 18번 염색체 결실임을 보여주었습니다. 염색체 1 영역 결실의 핵형 46 XN 짧은 팔은 염색체 영역 결실의 짧은 팔일 뿐이었다. NICS 결과는 염색체 18 영역 결실의 긴 팔과 염색체 1 영역 복제의 짧은 팔을 가진 핵형 46 XN을 보여주었습니다.
핵형은 5개의 염색체 복제였고 8개의 모자이크 차이를 보였지만 NICS 분석은 24개의 염색체 모두를 이수성으로 스크리닝할 수 있었습니다. 이 과정은 단일 정상 핵형 배반포를 옮기는 새로운 방법을 제공합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모계 기원 오염을 피하기 위해 적층 세포를 완전히 제거하고 DNA 함량이 증폭에 충분할 때 배양 배지와 설명된 배반포 단계를 수집하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
본 연구는 NICS 기술을 사용하여 WGA 및 WGS 라이브러리 준비 단계를 약 3시간 만에 간소화하고 약 9시간 만에 비침습적 CCS 결과를 옵트인했습니다. 개발 후 이 기술은 ART의 임상의에게 형태학적 평가와 NICS를 결합하여 형태가 양호한 배아를 자궁으로 이식하는 새로운 방법을 제공하여 진행 중인 임신율과 출생률을 향상시킬 수 있습니다.
