اسمي الدكتور شانكاري ناير، وأنا زميل ما بعد الدكتوراه في قسم الفيزياء الحيوية الإشعاعية في قسم الطب النووي في NRF، iThemba LABS. في هذا الفيديو، سوف نظهر استخدام فحص بؤر غاما H2AX الآلي على الخلايا الليمفاوية الطرفية في الدم البشري لاستخدامه في تطبيقات التماثل الدفعي. يتم التحكم في مخاطر الإشعاع على الموظفين بشكل صارم.
الإشعاع المؤين يؤثر بشكل مباشر على بنية الحمض النووي عن طريق تحفيز فواصل الحمض النووي. فواصل مزدوجة حبلا خاصة. واحدة من أقدم الخطوات في عملية التعرف على كسر الحمض النووي المزدوج حبلا هو phospohorilization البديل الهستون، H2AX، وتوظيف البروتينات إصلاح.
سيحدد هذا الفيديو استخدام المجهر لتسجيل عدد نواة جاما-H2AX foci ren-nucleus باستخدام نظام مسح الشرائح الآلي ومنصة التحليل، ودمج المجهر الفلوري. يتم عزل الخلايا الليمفاوية من الدم كله. تمييع الدم كله مع برنامج تلفزيوني في نسبة واحد إلى واحد، ثم وضع الدم المخفف بلطف على حجم واحد من متوسط الانحدار الكثافة.
طبقة الدم تدريجيا عن طريق عقد أنبوب مائلة في 45 درجة. نقل التعليق إلى جهاز طرد مركزي وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في 900 G.After المركزية أربع طبقات سوف تشكل. نقل بعناية طبقة غائمة تحتوي على الخلايا الليمفاوية في أنبوب مخروطي عقيم جديد.
غسل الخلايا الليمفاوية مع برنامج تلفزيوني والعد باستخدام مقياس الدم. بمجرد تحديد العدد الإجمالي للخلايا الليمفاوية ، قم بتمييع الخلايا الليمفاوية والتعليق إلى تركيز حوالي 800،000 خلية لمفاوية في ملليلتر واحد من RPMI الكامل. العينات وجاهزة للإشعاع لدينا.
يتم تشعيع الخلايا الليمفاوية بأشعة غاما من مصدر الكوبالت 60 ، وبعد ذلك يتم احتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة بنسبة 5٪. لكل حالة تشعيع أو أنبوب، يتم إعداد ثلاث شرائح. ضع الشريحة في حامل القصاصة، متبوعة ببطاقة التصفية، وأخيرا القمع.
مقاطع الشرائح الآمنة ومكان في جهاز الطرد المركزي الخلوي. أضف 250 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل قمع وتدور لمدة 30 G لمدة خمس دقائق. استخدام الطرد المركزي الخلوي ضروري للحصول على شروط موحدة على أتمتة الشرائح.
نسج مرة واحدة، وإزالة الشرائح من مقطع ومن ثم استخدام القلم الكاره للماء، رسم دائرة حول المكان الذي توجد فيه الخلايا. الآن بعد أن تم إجراء الشرائح ، تحتاج الخلايا إلى إصلاحها على الشريحة بحيث يمكن أن يحدث تلطيخ المناعة. يتم إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ بارافورمالديهايد، أو PFA، وحل برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
بعد تثبيت غسل الشرائح في جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. ثم، تغطية الخلايا مع تريتون X للسماح permeabilization. خطوة permeabilization يزيل المزيد من الدهون الغشاء الخلوي للسماح للأجسام المضادة للحصول على داخل نواة الخلية.
من هنا فصاعدا، نستخدم حل حظر مصنوع من 1٪ BSA في PBS، لغسل الشرائح من أجل تقليل الربط غير المحدد المحتمل. بعد ثلاث خطوات غسل من 10 دقائق مع 1٪ BSA و PBS، يتم احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة مع واحد إلى 500 الأجسام المضادة الأولية المضادة غاما H2AX لمدة ساعة واحدة في غرفة الترطيب، وإنجازها بسهولة عن طريق إضافة ورق الأنسجة الرطبة في قاعدة مربع تخزين الشرائح مستطيلة. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، قم ببقشيش السائل واغسل الشرائح مرة أخرى في محلول 1٪ BSA.
احتضان الشرائح مع واحد إلى ألف المخفف حمار الثانوية المضادة للفأرة TRITC الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في غرفة الترطيب. إزالة الأجسام المضادة قبل إجراء ثلاث أو 10 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني. قم بتغطية جرة كوبلين في رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء طوال مدة خطوات الغسيل.
إزالة الشرائح ومسح برنامج تلفزيوني الزائدة خارج دائرة الكاره للماء مع ورقة الأنسجة الخالية من الغبار. وأخيرا، إضافة قطرات واحدة إلى قطرتين من DAPI أدى إلى الإذعان تصاعد المتوسطة وتغطية الشرائح بلطف مع زلة الغطاء. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين ومن ثم تخزين العينات في مكان مظلم في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
امسح الشرائح برفق باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪، وضع الشرائح على منصة المسح الآلي، أو مرحلة الشريحة، المرفقة بصور المحور zite ZED-2 المجهر. حدد إعداد التصنيف ضمن علامة التبويب MetaCyte لتحرير المصنف. سيتم استخدام المصنف المحدد من قبل النظام لمسح وتسجيل الشرائح ، ويستند إلى مجموعة من المعلمات المحددة مسبقا ، والتي ستحدد كيفية اختيار النظام للخلايا وعشرات بؤر.
يمكن تحسين المصنف وتدريبه استنادا إلى عدد من حقول الصور المصنفة مسبقا. اعتمادا على تكبير المجهر ، ونوع والأجسام المضادة التي تستخدم لتلطيخ ، يمكن تحسين مصنف مختلف. لذلك تختلف المصنفات بشكل عام من مختبر إلى آخر ، لكننا سنعطي لمحة عامة عن الخطوات الأساسية التي يتم اتخاذها للنظر في وقت يجب تعديل إعداد المصنف.
ضمن Capture'tab، يمكن للمرء أن يجد عامل التصفية الذي سيتم استخدامه، هنا DAPI وTRITC، مع أقصى وقت للتكامل من 1.04 ثانية. ويستند هذا الأخير على المصنف الأصلي الذي تم توفيره من قبل الشركة وتعديله في وقت لاحق لكثافة الأجسام المضادة والخلفية غاما H2AX، أو إشارة TRITC، في هذا النوع من الخلايا المحددة، وهي الخلايا الليمفاوية. تحت علامة التبويب التعرض، يتم تعريف الحد الأدنى لوقت التكامل.
سيبقى المصنف دائما ضمن الحد الأدنى والحد الأقصى لوقت التكامل، مما يمنع التعرض الزائد أو الناقص للشريحة. ضمن Selection'tab الخلية، تم تعريف مناطق الكائن الحد الأدنى والحد الأقصى استنادا إلى حجم وشكل الخلايا التي يتم تحليلها. على سبيل المثال، قيمة التقعر المحددة مسبقا ونسبة العرض إلى الارتفاع محددة للخلايا الليمفاوية، والتي تحتوي بشكل عام على أشكال مستديرة.
ضمن علامة التبويب ميزات، يمكنك تغيير العرض وعرض المدرج التكراري، بالإضافة إلى تحديد ما يحتاجه المجهر للتسجيل. يمكن للنظام تسجيل العديد من العناصر ، اعتمادا على الميزات التي حددها المستخدم. مثال على ذلك هو عتبة كيفية تسجيل البرنامج للكائنات الفردية.
بمجرد التعرف على مصنف مناسب، حدد الإعداد في الشريط الجانبي وأعط كل شريحة اسما فريدا، متبوعا بتحديد المصنف المناسب. حدد الحد الأقصى لعدد الخلايا'، ثم أضف الحد الأقصى لعدد الخلايا المطلوب فحصها. يتم إنهاء البحث حتى إذا لم يتم مسح إطار البحث المحدد بالكامل بعد، بمجرد الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا.
بالنسبة لتطبيقات التماثل البيولوجي، فإن التسجيل الآلي ل 1000 خلية لكل شريحة يكفي، بالنظر إلى أنه يتم إعداد ثلاث شرائح لكل عينة دم. انقر فوق موافق'لتأكيد الإعدادات. لمسح الشرائح ضوئيا، حدد بحث'في الشريط الجانبي.
إذا تم تحديد الإعداد "إطار البحث اليدوي" في إعداد الشريحة، فسيفتح مربع حوار خطا لتحديد منطقة المسح الضوئي. باستخدام هدف 10 مرات يتم تحديد منطقة البحث مستطيلة على الشريحة بشكل تفاعلي عن طريق تحديد ركنين من حقل البحث بواسطة النقرة اليسرى من الماوس. يمكن تأكيد ذلك باستخدام الزر موافق.
ضبط موضع بدء التركيز. سيقوم البرنامج بمطالبة التركيز ومركز نواة مرجعية باستخدام هدف 40 مرة لكل شريحة وتأكيد الإعدادات مع موافق. سينتقل النظام تلقائيا إلى جميع الجوانب بشكل تسلسلي. إذا لزم الأمر، ضبط إعداد صورة مباشرة'و"وقت التكامل" لهذه الخطوة.
تحقق من جميع إعدادات المجهر. تأكد من أن رافعة أنبوب المجهر في وضع يحول كل الضوء إلى الكاميرا ويؤكد مطالبة النظام مع موافق. يبدأ النظام التركيز التلقائي للشبكة في موضع الشبكة الأقرب إلى الحقل المرجعي. هو يستمر أن يركز مجال على الشبكة نظامية, يتحرك في متعرج نحو الجبهة وخلف من البحث نافذة.
يبدأ المسح الضوئي عند اكتمال التركيز التلقائي للشبكة. يتم نقل المرحلة في حقل نمط تعرج بعد حقل لالتقاط البيانات. عندما يتم الكشف عن خلية، يتم وضعها ويتم تخزين صورة المعرض وعرضها في الشاشة ويتم تحديث عدد الخلايا.
يتم إنهاء البحث إذا تم مسح البحث بأكمله ضوئيا، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا، أو إذا تم إلغاء البحث. عند اكتمال الفحص، انقر بزر الماوس الأيمن على الشريط الموجود في الأسفل وافتح عينة. مراجعة المعرض، الذي يتكون من صور صغيرة للخلايا المكتشفة.
في هذه النافذة يمكنك تحديد الخلايا المخزنة في المعرض عن طريق المعيار ليتم اختيارها من القائمة المنسدلة. يتم عرض الخلايا بشكل عام بالترتيب الذي تم الكشف عنها. انقر على الرسم البياني جودة 'أو ميزة قيمة Diagram'لإعطاء توزيع الخلايا المكتشفة، فضلا عن وسائل، والانحراف المعياري لل البؤر سجل.
هنا نقارن بين العينات الرمادية صفر مقابل 1.5. هذه عادة شريحة تحكم، بقيمة متوسطة تبلغ 0.124 بؤرة لكل خلية، حيث لم يتم تشعيع الخلية. وفي سياق عدم التماثل البيولوجي، يشير ذلك إلى أن الشخص لم يتعرض لجرعة عالية من الإشعاع.
في الرسم البياني، يمكننا أن نرى أن غالبية الخلايا لديها تقريبا صفر بؤر لكل خلية، وليس هناك جانب من التوزيع الطبيعي. عندما نقارن هذا بجرعة من 1.5 رمادي، يمكن أن نرى بوضوح أن هذه عينة مشععة. وفي سياق التماثل البيولوجي، يشكل هذا التوزيع الطبيعي علامة واضحة على أن العينة قد تعرضت للإشعاع.
المسح الآلي حساس بما يكفي للكشف عن البؤر الناجمة عن جرعات منخفضة. تظهر النتائج زيادة خطية واضحة لعدد البؤر لكل خلية مع الجرعة. الطريقة الآلية للكشف عن كسر حبلا مزدوجة الحمض النووي مفيدة لتطبيقات عسر التماثل البيولوجي سريع وعالي الإنتاجية.
شكرا لك على المشاهدة
