كان الهدف من هذه المخطوطة هو تقييم مدى ملاءمة القياس الكمي المتزامن لبؤر جاما H2AX و 53BP1 لتقييم الضرر الجينومي الناجم عن الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية بواسطة بليوميسين. هناك عدة عوامل يمكن أن تسبب فواصل مزدوجة في الخصلة. وبالتالي يتم تزويد الخلايا بالعديد من آليات الإصلاح ، التي تتضمن كلا من Gamma H2AX و 53 Binding Protein 1 ، والتي يمكن أن تتمركز بالقرب من كسر الشريط المزدوج.
بعد جمع عينات الدم الكامل، أضف 300 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب يحتوي على 4.7 ملليلتر من الوسط الكامل. ثم أضف خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من التركيز النهائي لكبريتات بليوميسين. لكل عينة ، قم بإعداد عنصر تحكم سلبي.
ضع الأنبوب في ترموستات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. عينات الطرد المركزي في 540 G لمدة خمس دقائق. ثم أضف خمسة ملليلتر من محلول منخفض التوتر إلى الحبيبات.
ثم أضف 400 ميكرولتر من محلول التثبيت المسبق من أجل التسبب في انحلال الدم. عينات من أجهزة الطرد المركزي عند 540 جم لمدة خمس دقائق ، ثم إعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لإصلاح الخلايا. عينات الطرد المركزي عند 540 جم لمدة خمس دقائق ، ثم إعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المحلول المثبت.
كرر هذه الخطوة مرة أخرى. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 540 G لمدة خمس دقائق ، ثم تطمح إلى ترك الطافي حلا كافيا لإعادة تعليق الحبيبات. قم بإسقاط حبيبات الخلية المعاد تعليقها على الشرائح.
قم بإعداد المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة المضادة لجاما H2AX والأجسام المضادة الأولية المضادة ل 53BP1 الذائبة في محلول الحظر. ثم اغسل الشرائح مرتين في PBS 1X. ثم احتفظ بالشرائح لمدة 30 دقيقة في حل الحظر.
أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولترات من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الأولية الذائبة في محلول الحظر. تغطية الشرائح مع parafilm. احتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بعد الحضانة ، قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل في PBS 1X لمدة خمس دقائق. قم بإعداد المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الثانوية DyLight 488 و Alexa Fluor 568 المذابة في محلول الحظر. ثم أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولتر من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الثانوية الذائبة في محلول الحظر.
تغطية الشرائح مع parafilm واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد هذه الحضانة الثانية ، قم بإجراء ثلاث عمليات غسيل في PBS 1X لمدة خمس دقائق. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول Antifade مع DAPI على زلات الغطاء قبل التجميع لمواجهة تلطيخ النوى.
من أجل تقييم البؤر الحركية ، فإن الإجراء هو نفسه كما هو موضح الآن. المرحلة الأخيرة هي مراقبة وتحديد البؤر. تظهر الخلايا الليمفاوية البشرية بدون بؤر جاما H2AX و 53BP1 في A و B و C ، وتظهر الخلايا الليمفاوية البشرية بكميات مختلفة من بؤر Gamma H2AX و 53BP1.
لوحظ انخفاض مستوى التوطين المشترك للبؤر. كما هو متوقع ، لوحظ تردد أعلى جدا لكل من بؤر Gamma H2AX و 53BP1 بين الخلايا غير المعالجة غير المعالجة. أيضا ، لوحظ اختلاف كبير في عدد بؤر العلامتين.
أظهر المسار الزمني لبؤر Gamma H2AX و 53BP1 بمرور الوقت سلوكا مختلفا على الرغم من أنهما يساهمان في نفس الوظيفة. تحليل بؤر جاما H2AX و 53BP1 لديه القدرة على تقييم الاستجابة الخلوية في التعرض أو السياقات المرضية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي Gamma H2AX و 53BP1 المناعي المزدوج إلى التقليل من التردد الحقيقي للحدث.
