يتكون سير العمل من خلايا متنامية في ظروف بيئية خاضعة لرقابة صارمة ، وتقشعر لها الأبدان بسرعة باستخدام ذوبان الماء / الجليد وإصلاح مع تركيز الأمثل مسبقا من الفورمالديهايد ووقت الحضانة. ثم يتم إخماد رد فعل التثبيت باستخدام فائض من المركبات الأولية التي تحتوي على مجموعة أمينية، مثل الجليسين أو التريبس. يتم جمع الخلايا وغسلها ويمكن تخزينها مجمدة.
يمكن أن يتم الخلايا الثابتة ميكانيكيا أو كيميائيا، ويستخدم ليسات لفصل الكسور الريبوسومية على أساس حجمها الجزيئي، خصائص الترسيب أو علامات تقارب. وينتج عن هذا النهج مواد متعددة الاستخدامات قابلة للاستخدام للتنقية والكشف بمساعدة المناعة، وإثراء المجمعات التي تحتوي على عوامل محددة في المجهر الإلكتروني. عند الحجب العميق المترابط ، يصبح تضخيم الحمض النووي الريبي أو التحليلات القائمة على التهجين ، تسلسل الحمض النووي الريبي وقياس الطيف الكتلي ممكنا.
إعداد ثقافة الخميرة لتر واحد في شاكر المدارية مع كثافة بصرية بدءا لا يزيد عن 0.05 وحدات امتصاص في 600 نانومتر واستخدام وسائل الإعلام بيبتون وديكستروز في 30 درجة مئوية. إعداد جهاز طرد مركزي مع الدوار متوافق وزجاجات الطرد المركزي ل بيليه تعليق السائل من خلايا الخميرة في 5000 G في أربع درجات مئوية. الاحتفاظ بسجل للكثافة البصرية للخلايا المتنامية.
يجب أن يكون بين 0.6 إلى 0.8 وحدة امتصاص و 600 نانومتر في وقت الجمع إذا كانت مرحلة النمو الأسي ذات أهمية. مرة واحدة في الخلايا جاهزة، وإعداد icebox داخل غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائي مع خباز يحتوي على 250 غراما من الجليد المياه المسحوقة نظيفة وتظهر لك أيضا 25 ملليلتر تريبسين والميثانول المشتراة حديثا استقرت 37٪ حل الفورمالديهايد داخل غطاء محرك السيارة. صب ثقافة الخلية الأخيرة في الخباز الذي يحتوي على الجليد.
ثم أضف 75 ملليلتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى تركيز نهائي من 2.2٪ الوزن على حجم تحريك الخليط بشكل مكثف حتى يذوب الجليد. بمجرد ذوبان الجليد، قم بإعداد جهاز توقيت لمدة 10 دقائق بعد احتضانه لمدة 10 دقائق، ونقل الثقافة إلى زجاجات الطرد المركزي المبردة مسبقا وكريه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية، 5000 غرام لمدة خمس دقائق. في حين أن تدور هو، على ما قبل تبريد أنبوب 50 ملليلتر والحفاظ على العازلة الطازجة A التي تحتوي على الجليسين لتحييد أي الفورمالديهايد المتبقية على الجليد.
بعد الطرد المركزي، ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد مع جانب بيليه في اتصال مع الجليد. جلب الأنابيب في غطاء الدخان والتخلص من supernatant في حاوية النفايات الفورمالديهايد. إعادة تعليق بيليه الخلية من الأنابيب القديمة في 20 ملليلتر من العازلة A باستخدام شريط 25 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر.
تشكل حجم إلى 40 ملليلتر مع العازلة A وجمع خلايا الغسيل عن طريق الطرد المركزي من أربع درجات مئوية، 5000 G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 40 ملليلتر العازلة واحد، وهو العازلة A لا تحتوي على الجليسين لإزالة التلوث الجليسين. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية، 5000 G خمس دقائق.
كرر يغسل مع العازلة واحد، مرة أخرى. تجاهل supernatant ووضع بيليه الخلية على الجليد. وزن أنبوب مع بيليه، يجب أن تكون كتلة الخلية الرطب غرام واحد تقريبا لكل لتر واحد من ثقافة الخلية.
ملء البوليسترين من مربع اصطف مع رقائق الألومنيوم مع النيتروجين السائل إلى عمق ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات. ضعه في أنبوب 50 ملليلتر منتصبا في الصندوق. إعادة تعليق بيليه في 550 ميكرولتر من العازلة ألف اثنين عن طريق الأنابيب ودوامة لمدة 10 ثوان.
إضافة 10 ميكرولتر من 40 وحدة لكل مثبط RNase ميكروليتر ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثانية. باستخدام ماصة ملليلتر واحد، بالتنقيط تعليق الخلية في 50 ملليلتر اثنين تحتوي على النيتروجين السائل. للتحضير للخطوة التالية، قبل بارد 1.5 ملليلتر نواة أنابيب مجانية على الجليد الجاف و 10 ملليلتر من الفولاذ المقاوم للصدأ طحن الجرار.
نقل قطرات تعليق الخلية المجمدة في الجرار باستخدام ملعقة معقمة نظيفة. غمر الجرار طحن في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة، وضمان المرحلة السائلة لا يزال فوق تقاطع. إعداد مطحنة خلط كريو في 27 هيرتز للهياج لمدة دقيقة واحدة.
هياج الجرار طحن مختومة في 27 هيرتز لمدة دقيقة واحدة في طاحونة خلاط. إعادة تبريد الجرار في النيتروجين السائل كما كان من قبل ويهز لمدة دقيقة واحدة أخرى. نقل الجرار إلى مربع الجليد التي تحتوي على الجليد الجاف جنبا إلى جنب مع أنابيب نواة خالية 1.5 ملليلتر.
باستخدام ملعقة الصلب الصغيرة نقل النتائج في تاريخ طحن مبطن في الأنابيب. ثم تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية. في اثنين من قوارير T175 تنمو HEK 293 خلايا إلى 60 إلى 70٪ التقاء وDalbeko المعدلة النسر المتوسطة و 10٪ مصل البقر الجنين في 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
قبل ثلاث ساعات على الأقل من وقت التثبيت المطلوب، استبدل وسائط قارورة T175 ب 30 ملليلتر من الوسائط الكاملة التي تم تسخينها مسبقا. إعداد صندوق الثلج إلى حافة مع الجليد المياه سحقت والحفاظ على غطاء محرك السيارة الدخان جنبا إلى جنب مع المخازن المؤقتة المطلوبة، وأيضا الجليد. لالتقاط البرد الخلايا، وإزالة قارورة T175 من الحاضنة واضغط رسميا ضد الجليد ضمان أقصى قدر من الاتصال السطحي.
داخل غطاء الدخان الكيميائي، إمالة القارورة على جانبها بحيث تجمع وسائل الإعلام على الجانب المقابل للخلايا. ماصة 168 ميكرولتر من 37٪ وزنها من قبل حجم الفورمالديهايد مباشرة في وسائل الإعلام المجمعة. إعطاء تركيز نهائي من 0.2٪ الفورمالديهايد.
اخلط على الفور. احتضان القوارير على الجليد لمدة 10 دقائق أخرى. صب قبالة وسائل الإعلام في حاوية النفايات المناسبة من خلال الجانب قارورة مقابل الخلايا.
باستخدام strippete، ماصة في 30 ملليلتر من فوسفات دالبيكو عازلة المالحة دون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم وبالإضافة إلى ذلك تحتوي على 50 ملليمولار الجليسين بلطف على الجانب المقابل للخلايا. تخلط عن طريق هزاز القارورة، والعودة فلاش إلى الوضع الأفقي واحتضان لمدة 10 دقائق أكثر على الجليد. صب قبالة الحل من خلال الجانب قارورة مقابل الخلية وإضافة بلطف سبعة ملليلتر من معيار 0.25٪ trypsin EDTA حل لفصل وإعادة تعليق الخلايا.
احتضان القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، إلى أقصى حد 10 دقائق. حدد موقع القارورة عموديا واستخدام strippete، وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق غسل بلطف أي المتبقية من جدران القارورة ونقل التعليق إلى أنبوب 50 ملليلتر تعيين على الجليد. تكملة فورا حل تعليق جمعها مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة ومزيج عن طريق التقليب بلطف الأنبوب.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 100 غرام لمدة خمس دقائق وأربع درجات مئوية. يجب أن تكون بيليه الخلية واضحة للعيان. صب قبالة وسائل الإعلام وإعادة تعليق بلطف بيليه في 10 ملليلتر من الفوسفات دالبيكو المخزنة المالحة مع عدم وجود الجليسين.
الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 100 G لمدة خمس دقائق وعلى أربع درجات مئوية صب قبالة العازلة غسل وإعادة تعليق بيليه في 800 ميكرولتر من الجليد الباردة فوسفات دالبيكو عازلة المالحة مع عدم وجود الجليسين، ولكن تحتوي على المغنيسيوم أيونات الكالسيوم. نقل الخلايا إعادة تعليقها في بروتين منخفض جديد ملزمة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق. طرد أنبوب في 100 G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.
تجاهل بعناية supernatant باستخدام ماصة ملليلتر واحد. في هذه المرحلة، يمكن تجميد بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى خطوة تحلل الخلية. في خزانة السلامة الحيوية إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل على أساس المنظفات غير الأيونية، غير denaturing، وسبعة ميكرولترات من مثبط أرجيناسي وتخلط بشكل جيد عن طريق الأنابيب باستخدام طرف واحد ملليلتر.
إرفاق بعناية إبرة قياس 25 إلى حقنة 1-3 ملليلتر وماصة بقوة الخليط باستخدام ما لا يقل عن سبعة كمية بطيئة صعودا والسكتات الدماغية العادم سريع إلى أسفل. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة المهملات الحادة وكرر الإجراء بإبرة قياس 31 وحقنة 0.3 ملليلتر. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة المهملات الحادة.
طرد أنبوب في 12, 000 G لمدة خمس دقائق في أربع درجات لإزالة حطام الخلية. نقل supernatant إلى بروتين منخفض جديد ملزمة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تخزين كل من حطام الخلية وlysate في ناقص 80 درجة مئوية.
المجمعات الترجمية حساسة للتكوين الأيوني للمخازن المؤقتة. حذف كلوريد المغنيسيوم وإضافة خصائص الترسيب العالية التي ألغيت EDTA ، وبينما أدى كلوريد الكالسيوم إلى قمم نتائج أفضل ، كان التحسن هامشيا. وهكذا اخترنا العازلة واحدة.
2.2٪ الوزن من حيث الحجم الفورمالديهايد الحفاظ بشكل ممتاز على البوليسومات ولم يقلل من العائد العام مقارنة مع 4٪ الوزن من حيث الحجم الفورمالديهايد. في خلايا الثدييات، تم استخدام تركيز أقل بكثير من الفورمالديهايد من 0.2٪ الوزن من حيث الحجم. كما أدى ارتفاع تركيزات في فقدان المواد المتعددة الريبوسومات كبيرة.
15 ملليمولار EDTA إضافة إلى lysate وجميع المخازن المؤقتة اللاحقة أظهرت تأثير زعزعة استقرار أقل بشكل مميز على كسور متعددة الخلايا، المستمدة من الخلايا الثابتة. وقد تكرر هذا التأثير جزئيا مع EDTA 50 ملليمولار مع مواد من 4٪ خلايا ثابتة، ومقاومة، تتكشف بشكل أفضل. استنفاد الجلوكوز يثير واحدة من الآثار المثبطة الأكثر دراماتيكية وسريعة على الخميرة.
وأضاف كل من العصب وتسبب محليا الظروف الناجمة عن تفكيك متعدد الأضلاع كان قليلا، ولكن من الواضح أن أكثر البوليسومات الاحتفاظ بها في انخفاض الجلوكوز المضافة. الأهم من ذلك، المواد متعددة الخلايا من الخلايا الثابتة يدل على وجود تمييز كبير بين الخلايا المتعطشة وغير المتعطشة مما يدل على مدى ملاءمة تثبيت الفورمالديهايد للحفاظ على الاختلافات في العمليات التحويلية الديناميكية. في نهج مثل بايساكي تاي، قد يكون بالإضافة إلى الثاقبة لإزالة الوحدات الفرعية الريبوسومية الصغيرة التي لا تشارك في تسوية بشكل جيد مع رهيزوميس كاملة التي استخدمناها جهاز طرد فائق على مرحلتين، مما يسمح لعزل SSU، LSU، RS، RNase الديازيوم المقاوم، DS، والبوليسومات عالية الترتيب التي أكدها المجهر الإلكتروني من الكسور الثابتة.
وبالمقارنة مع الخلايا غير الثابتة، أظهرت المواد المأخوذة من الخلايا الثابتة وجودا مرتفعا للفصيل eIF4A في أسرع كسور ريبوسومية مترسبة. باستخدام مواد ثابتة من سلالة تابي eIF4A لالتقاط وإثراء eIF4A تحتوي على مجمعات مع حبات IDG المغناطيسية ، تمكنا من مراقبة الإثراء الانتقائي للeIF4A مقارنة بيتا أكتين في SSU و RS ، ولكن ليس كسور LSU من التدرج الثاني على RNase واحد تفكيك. بالمقارنة مع غيرها من أساليب الراحة النقلية ، فإن سرعة عمل الفورمالديهايد عبر أغشية الخلايا والطبيعة العشوائية للروابط المتقاطعة تبشر بالحفاظ على أقصى قدر من التنوع في وسيطات الترجمة المعقدة.
النتائج التي توصلنا إليها تتوافق مع قابلية استخدام تثبيت الفورمالديهايد السريع لتحقيق الاستقرار في المجمعات العابرة للغاية وفائدة الأدلة في سيناريوهات الاستجابات الخلوية السريعة للتغيرات البيئية أو ظروف الإجهاد.
