Рабочий процесс состоит из выращивания клеток в строго контролируемых условиях окружающей среды, быстрого охлаждения их с использованием талой воды / льда и фиксации с предварительно оптимизированной концентрацией формальдегида и временем инкубации. Затем реакцию фиксации гасят с использованием избытка первичных аминогрупп-содержащих соединений, таких как глицин или трипс. Клетки собираются, промываются и могут храниться замороженными.
Фиксированные клетки могут быть механически или химически лизированы, а лизат используется для разделения рибосомных фракций на основе их молекулярного размера, седиментационных свойств или маркеров сродства. В результате применения подхода получается универсальный материал, пригодный для иммуноассистической очистки и обнаружения, обогащения комплексами, содержащими специфические факторы в электронной микроскопии. При сшитой глубокой блокировке, анализе на основе амплификации или гибридизации РНК становится возможным секвенирование РНК и масс-спектрометрия.
Установите однолитровую дрожжевую культуру в орбитальном шейкере со стартовой оптической плотностью не более 0,05 единиц поглощения на 600 нанометров и используйте пептон и декстрозные среды при 30 градусах Цельсия. Установите препаративную центрифугу с совместимыми роторными и центрифужными баллонами для гранулирования жидкой суспензии дрожжевых клеток при 5000 Г при четырех градусах Цельсия. Ведите учет оптической плотности растущих клеток.
Он должен составлять от 0,6 до 0,8 единиц поглощения и 600 нанометров во время сбора, если фаза экспоненциального роста представляет интерес. Как только клетки будут готовы, установите ящик для льда внутри химического вытяжного шкафа с пекарем, содержащим 250 граммов чистого измельченного водяного льда, и покажите вам также 25 миллилитров трипсина и свежеприготовленный метанол стабилизированный 37% раствор формальдегида внутри капота. Налейте одну последнюю культуру клеток в пекарь, содержащую лед.
Затем добавьте 75 миллилитров 37% формальдегида к конечной концентрации 2,2% веса по объему интенсивно перемешивайте смесь до тех пор, пока лед не растает. После того, как лед растаял, установите таймер на 10 минут После инкубации в течение 10 минут переложите культуру в предварительно охлажденные бутылки центрифуги и гранулируйте клетки центрифугированием при четырех градусах Цельсия, 5000 г в течение пяти минут. Пока спин есть, на предварительно охладите 50-миллилитровую трубку и сохраните свежеприготовленный буфер А, содержащий глицин, чтобы нейтрализовать любой оставшийся формальдегид на льду.
После центрифугирования поместите трубки центрифуги на лед со стороной гранул, контактирующей со льдом. Занесите трубки в вытяжной шкаф и выбросьте супернатант в контейнер для отходов формальдегида. Повторно подвешивайте ячейку гранулы из старых трубок в 20 миллилитрах буфера А, используя 25-миллилитровый стрипет и передавая в 50-миллилитровую трубку.
Восполнить объем до 40 миллилитров буфером А и собрать промывные ячейки центрифугированием четыре градуса Цельсия, 5000 Г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки в буфере А объемом 40 миллилитров, который является буфером А, не содержащим глицина, для удаления загрязнения глицином. Гранулируйте клетки снова центрифугированием при четырех градусах Цельсия, 5000 Г пять минут.
Повторите стирки с буфером А еще раз. Выбросьте супернатант и поместите гранулу ячейки на лед. Взвесьте пробирку с гранулой, влажная клеточная масса должна составлять примерно один грамм на один литр клеточной культуры.
Наполните полистирол из коробки, облицованной алюминиевой фольгой, жидким азотом на глубину примерно три сантиметра. Поместите в 50-миллилитровую трубку в вертикальном положении в коробке. Повторно подвешивайте гранулу в 550 микролитров буфера А два путем пипетирования и вихря в течение 10 секунд.
Добавьте 10 микролитров по 40 единиц на микролитр ингибитора РНКАЗЫ и снова вихрь в течение 10 секунд. Используя одну миллилитровую пипетку, капните клеточную суспензию в 50 миллилитровые две, содержащие жидкий азот. Чтобы подготовиться к следующему этапу, предварительно охладите 1,5-миллилитровые свободные от ядра трубки на сухом льду и 10 миллилитров из нержавеющей стали.
Переложите замороженные капли клеточной суспензии в банки с помощью чистого стерильного шпателя. Погрузите банки для измельчения в жидкий азот на одну минуту, чтобы жидкая фаза оставалась над соединением. Установите криосмесительную мельницу при 27 Гц для перемешивания в течение одной минуты.
Перемешайте запечатанные помолочные банки при 27 Гц в течение одной минуты в смесительной мельнице. Повторно охладите банки в жидком азоте, как и раньше, и встряхните еще одну минуту. Переложите банки в ящик для льда, содержащий сухой лед вместе с трубками без ядра 1,5 миллилитра.
С помощью небольшого стального шпателя перенесите полученные результаты в мягкую шлифовальную дату в трубы. Затем храните тюбики при минус 80 градусах Цельсия. В двух колбах T175 клетки HEK 293 растут до 60-70% слияния и модифицированной среды Eagle Далбеко и 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 градусах и 5% углекислого газа.
По крайней мере, за три часа до желаемого времени фиксации замените носитель колбы T175 точно 30 миллилитрами предварительно нагретой полной среды. Подготовьте до краев ящик для льда измельченным водяным льдом и держите в вытяжном шкафу вместе с необходимыми буферами, а также льдом. Чтобы охладить клетки, извлеките колбу T175 из инкубатора и формально прижмите ее ко льду, обеспечив максимальный контакт с поверхностью.
Внутри химического дымового капюшона наклоните колбу на бок так, чтобы среда собиралась на стороне, противоположной клеткам. Пипетка 168 микролитров на 37% взвешивается по объему формальдегида непосредственно в объединенную среду. Дают конечную концентрацию 0,2% формальдегида.
Сразу перемешать. Высиживайте колбы на льду в течение 10 минут. Вылейте среду в соответствующий контейнер для отходов через сторону колбы, противоположную ячейкам.
Используя стрипте, пипетку в 30 миллилитрах фосфатного физиологического раствора Далбеко буферизуют без ионов кальция и магния и дополнительно содержат 50 миллимолярных глицинов осторожно на стороне, противоположной клеткам. Перемешайте, раскачивая колбу, верните вспышку в горизонтальное положение и высиживайте еще 10 минут на льду. Вылейте раствор через сторону колбы, противоположную ячейке, и осторожно добавьте семь миллилитров стандартного 0,25%-трипсина раствора ЭДТА для отсоединения и повторной приостановки клеток.
Инкубировать колбу при комнатной температуре в течение пяти, максимум 10 минут. Расположите колбу вертикально и с помощью зачистки соберите отсоединившиеся ячейки, аккуратно промыв все оставшиеся от стенок колбы и переместите суспензию в 50-миллилитровую трубку, установленную на льду. Немедленно дополните собранный суспензионный раствор 20 миллилитрами полной среды и перемешайте, осторожно перевернув трубку.
Гранулируйте ячейки путем центрифугирования трубки при 100 G в течение пяти минут и четырех градусов цельсия. Ячейка гранулы должна быть хорошо видна. Вылейте среду и осторожно повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах фосфатного буферного физиологического раствора Dalbeko без глицина.
Центрифугируйте трубку снова при 100 г в течение пяти минут и при четырех градусах Цельсия Вылейте буфер промывки и повторно приостановите гранулу в 800 микролитрах ледяного фосфатного буферного физиологического раствора Далбеко без глицина, но содержащего ионы магния и кальция. Переведите повторно взвешенные клетки в новую низкобелковую связывающую 1,5 миллилитр микроцентрифужную трубку. Центрифугируйте трубку при 100 Г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.
Осторожно выбросьте супернатант, используя один миллилитровый пипетчер. На этом этапе гранулу клетки можно заморозить при минус 80 градусах Цельсия или перейти к стадии лизиса клеток. В шкаф биобезопасности добавьте 300 микролитров буфера лизиса на основе неионного, неденатурирующего моющего средства и семь микролитров ингибитора аргиназы и хорошо перемешайте путем пипетирования с использованием одного миллилитра.
Осторожно прикрепите иглу 25 калибра к шприцу от одного до трех миллилитров и энергично пипеткой смесь, используя по крайней мере семь медленных восходящих впускных и быстрых нисходящих ходов выхлопных газов. Выбросьте шприц и иглу в корзину и повторите процедуру с помощью иглы 31 калибра и шприца 0,3 миллилитра. Выбросьте шприц и иглу в корзину остроты.
Центрифугируйте трубку при 12 000 G в течение пяти минут при четырех градусах, чтобы удалить обломки клеток. Перенесите супернатант в новую трубку микроцентрифуги с низким содержанием белка, связывающую 1,5 миллилитра. Храните как клеточный мусор, так и лизат при минус 80 градусах Цельсия.
Трансляционные комплексы чувствительны к ионному составу буферов. Исключение хлорида магния и добавление ЭДТА аннулировали высокие седиментационные свойства, и хотя хлорид кальция привел к лучшим пикам результатов, улучшение было незначительным. Таким образом, мы выбрали буферный.
2,2% массы по объему формальдегида превосходно сохраняли полисомы и не снижали общий выход по сравнению с 4% массой по объему формальдегида. В клетках млекопитающих использовалась гораздо более низкая концентрация формальдегида в 0,2% массы по объему. Поскольку более высокие концентрации приводили к значительным полирибосомальным потерям материала.
15 миллимоляров ЭДТА, добавленных к лизату, и все последующие буферы проявляли заметно меньшее дестабилизирующее действие на полисомальные фракции, полученные из фиксированных клеток. И этот эффект был частично воспроизведен с 50 миллимолярной ЭДТА с материалом из 4% фиксированных клеток, сопротивляющихся, разворачивающихся лучше. Истощение глюкозы вызывает одно из самых драматических и быстрых трансляционных ингибирующих эффектов на дрожжи.
Как добавленные нервы, так и локально вызывающие условия, индуцированные полисомная разборка была незначительной, но, по-видимому, больше полисом, сохраненных в глюкозе с низким добавлением. Важно отметить, что полисомальный материал из фиксированных клеток демонстрирует высокое различие между голодающими и неголодными клетками, что указывает на пригодность фиксации формальдегида для сохранения различий в динамических трансляционных процессах. В таких подходах, как tacy paysake, может быть дополнительно проницательным удаление небольших рибосомных субъединиц, которые плохо оседают с полными корневищами, для которых мы использовали двухступенчатое ультрацентрифугирование, позволяющее изолировать SSU, LSU, RS, УСТОЙЧИВЫЕ к РНКазе диасомы, DS и полисомы высокого порядка, подтвержденные электронной микроскопией фиксированных фракций.
По сравнению с нефиксированными клетками, материал из фиксированных клеток продемонстрировал повышенное присутствие лабильного eIF4A в самых быстрых осадочных рибосомных фракциях. Используя фиксированный материал из штамма тапи eIF4A для захвата и обогащения eIF4A, содержащего комплексы с магнитными бусинами IDG, мы смогли наблюдать селективное обогащение eIF4A по сравнению с бета-актином в SSU и RS, но не фракциями LSU из второго градиента при РНКазе одной разборки. По сравнению с другими методами трансляционного покоя быстрота действия формальдегида через клеточные мембраны и неизбирательный характер поперечных связей обещают сохранение максимального разнообразия промежуточных продуктов трансляционного комплекса.
Наши результаты соответствуют возможности быстрой фиксации формальдегида для стабилизации высокопреходящих комплексов и полезности доказательств в сценариях быстрых клеточных реакций на изменения окружающей среды или стрессовые условия.
