ワークフローは、厳密に制御された環境条件で細胞を成長させ、融解水/氷を使用して急速に冷却し、ホルムアルデヒドとインキュベーション時間の事前に最適化された濃度で固定します。次いで、グリシンやトリプスなどの過剰な一次アミノ基含有化合物を用いて固定反応を消光する。細胞は回収され、洗浄され、凍結して保存することができる。
固定細胞は機械的または化学的に分解することができ、リゾースは分子サイズ、沈積特性または親和性マーカーに基づいてリボソーム画分の分離に使用されます。このアプローチにより、免疫支援精製および検出に使用できる汎用性の高い材料が得られ、電子顕微鏡検査において特定の因子を含む複合体の濃縮が可能になります。架橋深いブロッキング、RNA増幅、ハイブリダイゼーションに基づく分析、RNAシーケンシング、質量分析が可能になります。
600ナノメートルで0.05吸光度単位以下の開始光学密度を持つ軌道シェーカーに1リットル酵母培養を設定し、30°Cでペプトンとデキストロース培地を使用します。5000 G の酵母細胞の液体懸濁液を摂氏 4 度でペレット化するための、互換性のあるローターと遠心分離ボトルを備えた先入遠心分離機を設置します。増殖する細胞の光学密度を記録します。
指数成長フェーズが目的である場合、収集時には0.6~0.8の吸光度単位と600ナノメートルの間でなければなりません。細胞の準備ができたら、250グラムのきれいな砕いた水氷を含むパン屋と化学煙フードの中にアイスボックスを設置し、25ミリリットルのトリプシンと購入したばかりのメタノール安定37%ホルムアルデヒド溶液をフード内に表示します。氷を含むパン屋に1つの最新の細胞培養物を注ぎます。
その後、37%ホルムアルデヒドの75ミリリットルを体積比2.2%重量の最終濃度に加え、氷が溶けるまで混合物を激しくかき混ぜます。氷が溶けたら、10分間タイマーを設定し、10分間インキュベートした後、培養液を予め冷却された遠心分離器瓶に移し、細胞を摂氏4度、5000Gで遠心分離してペレット化する。スピンは、50ミリリットルチューブを事前に冷却し、氷上の残りのホルムアルデヒドを中和するためにグリシンを含む新鮮なバッファーAを維持します。
遠心分離機の後、遠心管を氷に接触したペレット側の氷の上に置きます。チューブをヒュームフードに入れ、上清をホルムアルデヒド廃棄物容器に捨てます。25ミリリットルのストリッパーを使用して、50ミリリットルのチューブに移すバッファーAの20ミリリットルで古いチューブから細胞ペレットを再中断します。
バッファーAで体積を40ミリリットルにし、摂氏4度、5000Gの摂氏5000Gの遠心分離により洗浄細胞を5分間回収する。上清を捨てて40ミリリットルのバッファーA1に細胞ペレットを再び懸濁させ、グリシン汚染を除去するためにグリシンを含まない緩衝Aである。ペレットは、摂氏4度で遠心分離により再び細胞を、5000G5分。
バッファA1で、もう一度、このス述を繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを氷の上に置きます。ペレットでチューブを秤量すると、湿細胞塊は細胞培養の1リットル当たり約1グラムであるべきである。
アルミホイルに液体窒素を並べたボックスから約3センチメートルの深さまでポリスチレンを充填します。箱の中に直立して50ミリリットルのチューブに置きます。ペレットを550マイクロリットルのバッファーA2に再懸濁し、10秒間ピペット化し、ボルテックスする。
1マイクロリットルRNase阻害剤あたり40単位の10マイクロリットルを加え、再び10秒間ボルテックスを加えます。1ミリリットルのピペットを使用して、液体窒素を含む2つの50ミリリットルに細胞懸濁液を滴下する。次のステップに備えて、ドライアイス上の1.5ミリリットル核フリーチューブと10ミリリットルのステンレススチール研削瓶を事前に冷却します。
凍結した細胞懸濁液を清潔な生殖不能ヘラを使用して瓶に移します。粉砕瓶を液体窒素に1分間沈め、液相がジャンクションの上にとどまることを確認します。1分間攪拌のために27ヘルツでクライオミキシングミルを設定します。
密封された研削瓶を27ヘルツでミキサーミルで1分間攪拌します。前のように液体窒素で瓶を再冷却し、さらに1分間振ります。1.5ミリリットルの核フリーチューブと一緒にドライアイスを含む氷箱に瓶を移します。
小さなスチールスパチュラを使用して、パッド入りのグラインド日付でチューブに結果を移します。その後、マイナス80度でチューブを保存します。2つのT175フラスコでは、HEK 293細胞を60〜70%合流させ、ダルベコの改変イーグル培地と10%の牛血清を37度および5%の二酸化炭素で増殖させる。
所望の固定時間の少なくとも3時間前に、T175フラスコの培地を正確に30ミリリットルの完全な媒体を加温して交換する。砕いた水氷で満ちたっまでアイスボックスを準備し、必要なバッファ、また氷と一緒にヒュームフードに保管してください。細胞を冷却するために、インキュベーターからT175フラスコを取り出し、氷に対して正式に押して最大表面接触を確保します。
化学煙フードの内側で、フラスコを横に傾け、メディアが細胞の反対側に集まるようにします。ピペット168マイクロリットルの37%は、体積ホルムアルデヒドによってプールされた媒体に直接計量した。0.2%ホルムアルデヒドの最終濃度を与える。
すぐに混ぜます。さらに10分間氷の上にフラスコをインキュベートします。細胞とは反対側のフラスコ側を通して適切な廃棄物容器に媒体を注ぎ出す。
ストリップピートを使用して、カルシウムとマグネシウムイオンなしでダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の30ミリリットルのピペットと、さらに細胞と反対側の側に50ミリモルグリシンを静かに含む。フラスコを揺らすことで混ぜ、フラッシュを水平位置に戻し、氷の上でさらに10分間インキュベートします。細胞の反対側のフラスコ側から溶液を注ぎ、標準的な0.25%トリプシンEDTA溶液の7ミリリットルを静かに加えて、細胞を取り外して再中断します。
フラスコを室温で5分間、最大10分間インキュベートします。フラスコを垂直に見つけてストリップピートを使用し、フラスコの壁から残った部分を静かに洗って取り外した細胞を採取し、懸濁液を氷上にセットした50ミリリットルのチューブに移します。回収した懸濁液を20ミリリットルの完全な培地ですぐに補い、チューブを軽くひっくり返して混ぜます。
100Gでチューブを5分4度の摂氏で遠心して細胞をペレットにする。細胞ペレットははっきりと見える必要があります。培地を注ぎ、グリシンなしでダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の10ミリリットルでペレットを穏やかに再中断します。
チューブを再び100 Gで5分間、摂氏4度で洗浄バッファーを注ぎ、氷冷ダルベコのリン酸緩衝生理食塩水の800マイクロリットルにグリシンを含むがマグネシウムとカルシウムイオンを含むペレットを再中断します。再懸濁した細胞を新しい低タンパク質結合1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。チューブを摂氏4度で3分間100Gで遠心分離します。
1ミリリットルのピペッタを使用して上清を慎重に捨てます。この段階では、細胞ペレットをマイナス80°Cで凍結するか、細胞のリシスステップに進むことができる。バイオセーフティキャビネットでは、非イオン性、非変性洗剤、および7マイクロリットルのアルギネーゼ阻害剤に基づいて300マイクロリットルのライシスバッファーを追加し、1ミリリットルのチップを使用してピペット処理することによってよく混合します。
慎重に1〜3ミリリットルの注射器に25ゲージの針を取り付け、少なくとも7つの遅い上向きの摂取量と速い下向きの排気ストロークを使用して混合物を激しくピペットします。注射器と針をシャープのビンに捨て、31ゲージ針と0.3ミリリットルの注射器で手順を繰り返します。注射器と針をシャープのビンに捨てます。
チューブを12,000 Gで4度で5分間遠心分離し、細胞の破片を取り除く。上清を新しい低タンパク質結合1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。細胞の破片とライセートの両方をマイナス80°Cで保存します。
翻訳複合体は、バッファーのイオン組成に敏感です。塩化マグネシウムの省略とEDTAの添加は高い沈殿特性を示し、塩化カルシウムはより良い結果ピークをもたらしたが、改善は限界であった。こうしてバッファ1を選択しました。
2.2%重量分量ホルムアルデヒドは、ポリソームを優れた保存し、体積ホルムアルデヒドによる4%重量と比較して全体的な収率を低下させなかった。哺乳類細胞では、体積で0.2%重量のホルムアルデヒドのはるかに低い濃度が使用された。より高い濃度として、実質的なポリボソーム物質損失をもたらした。
15ミリモルEDTAをライセートに添加し、その後のすべての緩衝液は、固定細胞に由来する多染色体画分に対して顕著に少ない不安定化効果を示した。そして、この効果は、4%固定細胞からの材料で50ミリモルEDTAで部分的に複製され、抵抗し、より良く展開した。グルコース枯渇は、酵母に対する最も劇的かつ迅速な翻訳阻害効果の1つを引き出します。
神経の追加および局所的に引き起こす状態の両方がわずかにポリソーム分解を誘発したが、明らかに低添加グルコースに保持されるより多いポリソームである。重要なことに、固定細胞からの多染色体物質は、動的移動過程の違いを維持するためのホルムアルデヒド固定の適合性を示す飢餓細胞と非飢餓細胞の間の高い区別を示している。粘着性の支払いなどのアプローチでは、2段階の超遠心分離を採用した完全な根茎とうまく一緒に沈着しない小さなリボソームサブユニットを除去し、SSU、LSU、RS、RNase耐性ジアゾメ、DS、および電子分画によって確認された高次ポリソームの分離を可能にする、さらに洞察力があるかもしれません。
非固定細胞と比較して、固定細胞からの物質は、最も速い沈み込みリボソーム画分における不安定性eIF4Aの上昇存在を示した。eIF4Aタピ株の固定材料を使用して、磁気IDGビーズを含む複合体を含むeIF4Aを捕捉し、濃縮し、RNase1分解時の第2勾配からのLSU画分ではなく、SSUおよびRSのβ-actinと比較してeIF4Aの選択的濃縮を観察することができました。他の翻訳残りの方法と比較して、細胞膜を越えたホルムアルデヒド作用の迅速性とクロスリンクの無差別な性質は、翻訳複合体中間体の最大の多様性の保全を約束する。
我々の知見は、環境変化やストレス状態に対する急速な細胞応答のシナリオにおける非常に一過性の複合体および証拠の有用性を安定させるために、急速なホルムアルデヒド固定の有用性に適合する。
