تجارب NMR عالية الضغط للكشف عن حالات المطابقة منخفضة البروتين

الضغط العالي هو الطريقة المفضلة لتغيير السكان النسبية لعينة من البروتين. وهو مفيد للغاية لعزل وتميز الدول عالية الطاقة تشكيلية. بالمقارنة مع جميع طرق الاضطراب، مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، من السهل تطبيق اضطراب الضغط وعكسه بالكامل.

بل هو أيضا اضطراب المحلية، التي تؤثر في المقام الأول على المناطق مع تجاويف الزجاج أو أحجام الفراغ. للبدء، أدخل عينة النيتروجين-15 المسمى في أنبوب الزركونيا باستخدام ماصة زجاجية، وضمان مقاعد العينة في الجزء السفلي من الأنبوب. لمنع العينة من الاختلاط مع السائل انتقال، تراكب العينة مع 200 ميكرولتر من النفط المعدني، ومن ثم ملء بقية الأنبوب مع السائل انتقال.

وضع O-حلقة ذات استخدام واحد على رأس أنبوب الزركونيا والانزلاق أنبوب في القاعدة. ثم قم بتوصيل الأنبوب بخط الحبل عالي الضغط وشد القاعدة بالخلية باليد. ثم تطبيق 14.7 نيوتن متر عزم الدوران لمنع تسرب في الضغط المنخفض.

للتحقق من سلامة تجميع خلايا الضغط، قم بالضغط على الأنبوب حتى 300 شريط خارج المطياف باستخدام دعم الخلية ووعاء الاحتواء. بعد 15 دقيقة، قم بإعادة ضبط الضغط على شريط واحد وتحقق من وجود تسربات بمسح نظيف خال من الوبر. أدخل الأنبوب غير المضغوط في المطياف بتوجيه خط الحبل بعناية.

قم بتمرير الأنبوب إلى مطياف حتى يصل الأنبوب إلى موضع الجلوس بالعينة. قفل، شيم، المباراة وضبط البروتيوم والنيتروجين قنوات وحفظ الشيم الأمثل للمستقبل. إعداد الاسترخاء العرضي الأمثل التحليل الطيفي مع مطياف متماسك واحد الكم غير المغايرة والمضي قدما في تسجيل تجربة مرجعية في الظروف الجوية.

سجل سلسلة من التجارب 2D من شريط واحد إلى 2.5 كيلوبار لكل 500 أشرطة. إذا كانت معدلات الطي الدقيقة أو التي تتكشف معروفة، بعد كل زيادة 500 شريط، دع العينة متساوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. عندما تصل نقطة انقلاب الانتقال القابل للطي أو التي تتكشف، سجل تجارب إضافية لتحسين دقة الملاءمة.

تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاعتماد على الضغط من RRM2، والثانية الحمض النووي الريبي الاعتراف عزر غير متجانسة النووية ribonucleoprotein A1. تم جمع التحليل الطيفي الأمثل للاسترخاء العرضي باستخدام أطياف التحليل الطيفي للتماسك أحادي الكم غير المتجانس في شريط واحد و1.5 كيلوبار واثنين من الكيلوبار و2.5 كيلوبار. وRRM2 تتكشف تماما تقريبا ضمن نطاق 2.5 كيلوبار. تم تركيب ملامح كثافة الضغط الفردي وفقا للمعادلة الموضحة هنا ، للحصول على التغييرات المقابلة في الطاقة الحرة القياسية جيبس وحجم المرتبطة رد الفعل تتكشف.

عند تعيينها على هيكل المجال ، تم العثور على المخلفات ذات أكبر حجم من تغيير الحجم داخل النواة الهيكلية للمجال ، في حين أن تلك التي لها أصغر حجم من تغيير الحجم كانت موجودة بشكل رئيسي في حلقات الربط بين خيوط بيتا وخيط بيتا إلى الحلزون الطرفي C. للتحقيق في درجة الضغوط والتغايرية التركيبية لفرقة الدولة المطوية ، تم تحليل التحولات الكيميائية البروتيوم. تم تركيب ملامح فردية للتحولات الكيميائية البروتيوم كدالة للضغط باستخدام المعادلة المعروضة، لاستخراج المعاملات الخطية وغير الخطية الخاصة بالموقع.

تم العثور على المخلفات ذات أكبر المعاملات غير الخطية في الغالب في النواة الهيكلية للمجال ، في حين كانت المخلفات ذات أصغر المعاملات غير الخطية موجودة في الغالب داخل حلقات تربط بين الزخارف الهيكلية المختلفة. من المهم إعداد الأنبوب كضغط تم ضبطه بشكل صحيح ، لمنع التسرب. إذا حدث تسرب، فإن التحقيق ربما يجب إزالتها لتنظيف أي أثر للنفط المعدني.