يظهر هذا البروتوكول إنتاج دودة الجيش الخريفية المعدلة وراثيا باستخدام نظام التحول القائم على piggyBac. نأمل أن تفيد هذه الطرق تحسين التحول ، ليس فقط في دودة الجيش الخريفية ، ولكن أيضا الحشرات lepidopteran. الطريقة الموصوفة هنا تجعل التحول الجرثومي لحشرات الآفات اللبيدوبتران فعالا.
إثبات الإجراء سيكون الدكتور شين تشن، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. تبدأ بوضع 12 جروا ذكر و 12 جروة أنثى في صندوق. ضع محلول السكروز بنسبة 10٪ في المربع لإطعام البالغين.
غطي الصندوق بمنشفة ورقية. في اليوم الثاني بعد الانهيار، يعرض البالغين للضوء الشديد بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث بعد الانهيار، نقل البالغين إلى مكان مظلم.
جمع الأجنة في غضون ساعتين بعد أكثر من موقف. أضف قطرات من الماء إلى قطعة المنشفة الورقية مع البيض الطازج المحفوظ في طبق بيتري على الجليد. نقل البيض بلطف إلى شريحة زجاجية مع فرشاة ناعمة ومحاذاتها واحدا تلو الآخر على شريحة زجاجية.
الحفاظ على الشرائح الزجاجية مع البيض الانحياز على الجليد قبل microinjection. حقن خليط من 200 نانوغرام لكل microliter piggyBac القائم على EGFP التعبير عن البلازميد، 200 نانوغرام لكل piggyBac microliter مفرط نقل الحمض النووي الريبي، والماء المقطر العقيم في البيض باستخدام ضغط التعويض من microinjector الآلي. الحفاظ على البيض المحقون في 27 زائد أو ناقص درجة مئوية واحدة، 60 زائد أو ناقص 10٪ الرطوبة النسبية حتى الفقس.
تغذية اليرقات المفقسة على نظام غذائي اصطناعي ، ونقل كل يرقة إلى كوب صغير واحد في مرحلة التخثر المبكر والنجوم. جمع الخوخ ووضع ما يقرب من 150 أنثى و 150 من الذكور الخوادر في قفص. عدة قطع من المناشف الورقية بحجم 30 سنتيمترا في 15 سنتيمترا في القفص لجمع البيض.
جمع المناشف الورقية مع البيض يوميا، والحفاظ على البيض في الظروف المناسبة حتى الفقس. احتفظ بيرقات حديثي الولادة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لشل حركتها ، ثم نقلها إلى صفيحة باردة جليدية. فحص يرقات حديثي الولادة المشلول تحت مجهر ستيريو مضان.
حدد حديثي الولادة الإيجابية EGFP، ورفعها إلى مرحلة pupal، في حوالي أسبوعين في 27 زائد أو ناقص درجة مئوية واحدة. تم الكشف عن piggyBac مفرط نقل ميرنا توليفها في المختبر باستخدام هلام Agarose 1٪. لم تظهر الأجنة التي تحقنها PDS إشارة EGFP ، في حين أظهرت البلازميد المعبر عن EGFP والأجنة التي يتم حقنها من قبل piggyBac مفرط النشاط مضانة EGP ، مما يشير إلى أن بناء piggyBac كان ناجحا.
أظهرت يرقات G1 التي تم الحصول عليها من البيض الناتج عن صليب ذاتي للبالغين G0 إشارة EGFP قوية. تم تضخيم جزء يحتوي على المروج وجزء EGFP بنجاح باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول عن اليرقات الإيجابية ل EGFP كنموذج. ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف نفس الجزء عندما تم عزل الحمض النووي الجينومي عن اليرقات البرية مثل القالب.
يجب أن يكون البيض للميكروبيكشن طازجا قدر الإمكان ويجب أن يبقى دائما على الجليد قبل الميكرويكشن لإبطاء تطوره. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين للإجابة على الأسئلة في علم الجينوم الوظيفي لحشرات الآفات وتطوير طرق مكافحة وراثية لهذه الآفة العالمية.
