이 프로토콜은 돼지 박 기반 변환 시스템을 사용하여 형질 전환 육군 벌레의 생산을 보여줍니다. 우리는 이러한 방법이 가을 육군 벌레뿐만 아니라 lepidopteran 곤충뿐만 아니라 변환을 개선하는 데 도움이되기를 바랍니다. 여기에 설명된 방법은 lepidopteran 해충 곤충의 생식선 변환을 효율적으로 만듭니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료 인 Xien Chen 박사가 될 것입니다. 먼저 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 상자에 넣습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 상자에 10% 자당 용액을 놓습니다.
종이 타월로 상자를 덮습니다. 둘째 날, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출. 3일째에는 성인을 어두운 곳으로 옮는다.
위치를 초과 한 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다. 신선한 달걀을 얼음 위에 넣은 신선한 달걀과 함께 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다.
유리 슬라이드를 미세 주입 하기 전에 얼음에 정렬 하는 계란으로 유지 합니다. 마이크로리터 피기박 계 EGFP 발현 마이크로리터 피기박 계 EGFP당 200 나노그램의 혼합물을 마이크로리터 활동적인 피기박 트랜스포사아제 mRNA당 200 나노그램, 자동 마이크로인젝터의 보상 압력을 사용하여 알에 멸균 증류수를 주입한다. 주입된 계란을 섭씨 27도 이상 또는 마이너스 1도, 부화할 때까지 60플러스 또는 마이너스 10%의 상대 습도로 유지하십시오.
부화한 애벌레를 인공 식단에 먹이고 각 유충을 초기 커드와 스타 스테이지에서 작은 컵 한 잔으로 옮기습니다. 강아지를 수집하고 케이지에 약 150 여성과 150 수컷 강아지를 배치합니다. 계란을 수집하기 위해 케이지에 크기 15 센티미터 에 의해 30 센티미터 30 센티미터의 종이 타월의 여러 조각을 걸어.
매일 달걀로 종이 타월을 수집하고 부화 할 때까지 적절한 조건에서 계란을 유지하십시오. 신난 유충을 섭씨 4도에서 5분간 유지하여 고정한 다음 얼음 냉판에 옮긴다. 형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오.
EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27플러스 또는 섭씨 1도를 뺀 후 약 2주 만에 푸팔 단계로 올리세요. 시험관내에서 합성된 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA는 1%아가로즈 젤을 사용하여 검출되었다. PDS 주입 배아는 EGFP 신호를 보여주지 않았고, EGFP 표현 플라스미드 및 활동적인 피기박 트랜스포사제 mRNA 주입 배아는 PGP 형광을 보였으며, 이는 돼지박 건설이 성공적이었음을 나타냅니다.
G0 성인의 자기 십자가에서 유래 하는 계란에서 얻은 G1 애벌레 강한 EGFP 신호를 보였다. 프로모터 및 EGFP 단편을 함유한 단편은 EGFP 양성 애벌레로부터 분리된 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 성공적으로 증폭되었다. 그러나, 동일한 단편은 유전체 DNA가 야생형 애벌레로부터 템플릿으로 분리되었을 때 검출되지 않았다.
미세 주입을 위한 계란은 가능한 한 신선해야 하며, 개발을 늦추기 위해서는 미세 주입 전에 얼음에 보관해야 합니다. 이 기술은 해충 곤충 기능적인 유전체학에 있는 질문에 대답하고 이 글로벌 해충을 위한 유전 통제 방법을 개발하는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.
