פרוטוקול זה מראה ייצור של תולעת צבא סתיו מהונדסת באמצעות מערכת טרנספורמציה מבוססת piggyBac. אנו מקווים כי שיטות אלה יועילו לשיפור השינוי, לא רק בתולעת צבא הסתיו, אלא גם חרקים lepidopteran. השיטה המתוארת כאן הופכת את הטרנספורמציה הנבטית של חרקי מזיקים לפידופרנים ליעילה.
מדגים את ההליך יהיה ד"ר שין חן, פוסט דוקטורט במעבדה שלי. התחל על ידי הצבת 12 גלמים זכר ו 12 גלמים נקבה בקופסה. מניחים פתרון 10% סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.
מכסים את הקופסה במגבת נייר. ביום השני לאחר ההסתה, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי בן לילה. ביום השלישי לאחר ההסתה, העבירו את המבוגרים למקום חשוך.
לאסוף את העוברים בתוך שעתיים לאחר מעל המיקום. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת הנייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית.
שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים מיושרות על קרח לפני microinjection. הזריקו תערובת של 200 ננוגרם לכל מיקרוליטר piggyBac מבוסס EGFP מבטא plasmid, 200 ננוגרם לכל microliter piggyBac transposase mRNA, ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים באמצעות לחץ הפיצוי של microinjector האוטומטי. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס, 60 פלוס או מינוס 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
מאכילים את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, ומעבירים כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ההקלה והכוכבים המוקדמים. לאסוף את הגולם ומניחים כ 150 נקבה ו 150 גלמים זכר בכלוב. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר 30 ס"מ על 15 ס"מ בגודל בכלוב כדי לאסוף את הביצים.
לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים בתנאים המתאימים עד הבקיעה. שמור את זחלי הניאון בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח. מסך זחלי ניאון משותק תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.
בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגולי, בסביבות שבועיים ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס. piggyBac hyperactivesase mRNA מסונתז במבחנה זוהה באמצעות ג'ל אגרוז 1%. העוברים שהוזרקו ל-PDS לא הראו אות EGFP, ואילו הפלסמיד המבטא EGFP ו- piggyBac transposase עוברים מוזרקים מ- mRNA הראו פלואורסצנטיות EGP, מה שמצביע על כך שבניית piggyBac הצליחה.
זחלי G1 שהתקבלו מביצים הנובעות מצלב עצמי של מבוגרים G0 הראו אות EGFP חזק. קטע המכיל את האמרגן ואת שבר EGFP הוגבר בהצלחה באמצעות ה- DNA הגנומי המבודד מהזחלים החיוביים ל- EGFP כתבנית. עם זאת, אותו שבר לא זוהה כאשר DNA גנומי היה מבודד מן הזחלים מסוג בר כמו התבנית.
הביצים למיקרו-ינון צריכות להיות טריות ככל האפשר ויש לשמור עליהן תמיד על קרח לפני המיקרו-יז'ק כדי להאט את התפתחותן. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לענות על שאלות בגנומיקה תפקודית של חרקים מזיקים ולפתח שיטות בקרה גנטיות למזיק העולמי הזה.
