أحد التحديات في أبحاث الشبكية هو دراسة الحديث المتبادل بين الخلايا المختلفة ، مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. على وجه الخصوص ، يعد عزل وزراعة الخلايا العصبية في شبكية العين أمرا صعبا. نعتقد أن نبات الشبكية المستزرع يمكنه التغلب على هذا القيد وتقديم نظام فريد خارج الجسم الحي يسمح لنا بدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة ، تحت معايير كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ، ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية.
أيضا ، يعد استئصال شبكية العين أداة فحص بارزة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الشبكية الوعائية والتنكسية العصبية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والذي يتميز بإصابة الأوعية الدموية والعصبية. يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية ، مما يعزز ضعف الشبكية الوعائية الدقيقة لسنوات. مكننا استخدام مجموعة متنوعة من النماذج بما في ذلك النماذج في الجسم الحي والمختبر من تحسين الكثير من التقنيات داخل مختبرنا.
هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لنباتات شبكية العين المشتقة من فأر بالغ من النوع البري يمكن الاحتفاظ به في المزرعة لمدة أسبوعين. الحفاظ على الحيوانات في إيواء تحت درجة حرارة ثابتة وبيئة يتم التحكم فيها بالضوء. افحص كل بحثا عن الصحة والغذاء الكافي والماء.
تأكد من تزويد الحيوانات بالطعام الطازج والمياه النظيفة. تغيير الأقفاص المتسخة على أساس يومي أو حسب الحاجة لصحة الحيوانات. استخدم ذكور 6 فئران سوداء يزيد عمرها عن 12 أسبوعا.
القتل الرحيم للحيوانات في قفص منزلهم عن طريق استنشاق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. بعد الانتهاء من الإجراء ، تأكد من موت الحيوان بالطريقة المناسبة ، مثل تأكيد السكتة القلبية والتنفسية أو مراقبة التلاميذ الثابتة والمتوسعة للحيوان. اتبع تأكيد الوفاة بطريقة ثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم.
اضغط على المدار باستخدام ملقط منحني حتى تبرز الكرة الأرضية. أغلق الملقط برفق في الجزء الخلفي من العين وارفعه بحركة مستمرة. اغمر مقلة العين في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على HBSS بارد ثلجي واحد ملليلتر.
انقل مقلة العين إلى أنبوب سعة 1.5 أو ملليلتر يحتوي على وسائط كاملة. الآن هو جاهز للتشريح. يوضح هذا الرسم البياني الخطوات المتتالية التي سيتم عرضها لتشريح مقلة عين الفأر لإنشاء زرع الشبكية.
يتم إجراء شق محيطي على طول الحافة لفتح مقلة العين. تتم إزالة القرنية عن طريق التشريح على طول شق القزحية. ثم تتم إزالة العدسة والجسم الزجاجي ، تاركة كوبا فارغا للعين.
عن طريق إمساك منطقة رأس العصب البصري بالملقط الدقيق ، يتم تقشير الطبقة الخارجية للعين بلطف. اهتمام كبير أثناء إزالة الغلاف الخارجي حتى لا تجرح الشبكية العصبية وتكون شبكية العين سليمة تماما. بعد ذلك ، سيتم قطع شبكية العين إلى قطع أصغر.
ستكون هذه ميزة كبيرة ، لأنها ستسمح لك بإجراء تجربة حيث يتم اشتقاق مجموعة التحكم والمجموعات التجريبية من نفس الحيوان. ومع ذلك ، فإن قطع شبكية العين إلى قطع صغيرة سيجعل التعامل معها أكثر صعوبة. لذلك ، قمنا بتطوير تقنية للتعامل مع قطع الشبكية الصغيرة هذه لضمان التوجيه الصحيح لثقافة شبكية العين.
اذهب مع شفرة مقص التشريح مفتوحة أسفل قطعة الشبكية مباشرة. ارفع قطعة الشبكية ببطء بطرف شفرة مقص مفتوحة وانقلها برفق إلى لوحة الثقافة. سيتم نقل النباتات الخارجية بشكل منفصل إلى إدخالات زراعة الخلايا في ألواح متعددة الآبار ، يحتوي كل منها على 300 ميكرولتر من وسائط زرع الشبكية مع توجيه جانب الشبكية العصبي لأعلى.
سيتم الحفاظ على مزارع زراعة الشبكية في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكد من أن سطح الشبكية متجها لأعلى. إذا كانت قطعة الشبكية مقلوبة أو مطوية ، فحاول ضبطها برفق على الاتجاه الصحيح.
سيؤدي الفشل في وضع زرع الشبكية في الاتجاه الصحيح مع مواجهة الشبكية العصبية لأعلى إلى فشل النمو السليم لخلايا الشبكية في الثقافة. هنا ، يمكننا أن نرى التألق المناعي يلطخ نباتات الشبكية الملطخة بالثقافة لمدة أسبوعين. تم إصلاح النباتات الخارجية وتلطيخها ب NeuN للخلايا العصبية في شبكية العين ، و GFAP للخلايا الدبقية ، والليكتين للأوعية الدموية.
أظهر التلوين خلايا شبكية متطورة وأوعية شبكية. هنا ، يمكننا أن نرى تلطيخ التألق المناعي لنباتات الشبكية الثابتة والملطخة ب GFAP للخلايا الدبقية والليكتين للأوعية الدموية. تظهر الصور تلطيخا معيبا وتخلفا في كل من خلايا الشبكية والأوعية الشبكية.
وذلك لأن نبات الشبكية كان مطويا ولم يتم توجيهه بشكل صحيح على لوحة الثقافة. يجب إيلاء اهتمام كبير للتوجيه الصحيح للمصنع مع توجيه شبكية العين لأعلى. إن اشتقاق المجموعة الضابطة من نفس الحيوان مثل المجموعة المعالجة يجعل من المفيد جدا إجراء مقارنة أكثر موثوقية للظروف التجريبية المختلفة.
يمكن أن توفر غرسات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية ، مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية.
