بدعم من جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى، والمعاهد الوطنية للصحة منح EY19312 EY19543 (VJK)، وكذلك منح المطلقة من البحوث للوقاية من العمى وEY02687 (قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن).

1. صنع أقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أقطاب الزجاج. وزنه 120 ملغ أجار ومزجها في الماء المقطر 10 مل (نهائي تركيز أجار 1.2٪). إذابة حل أجار في حمام الماء الساخن. شغل الزجاج الشعيرات الدموية (نستخدم أدوات Presision كلمة TW100-4 الشعيرات الدموية مع الأبعاد التالية: الطول = 100 مم، OD / ID = ملم 1/0.75، وحجم داخلي = 44 ميكرولتر) مع الحل أجار باستخدام المحاقن البلاستيكية. يصلب أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. وبالتالي، ما يصل إلى ~ يمكن ملء 200 الشعيرات الدموية (ويمكن تخزين ما تبقى من خليط أجار في -4 درجة مئوية، وإعادة استخدامها عدة مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشعيرات الدموية الى نصفين باستخدام سكين الماس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الأقطاب زجاج مما أدى إلى حل القطب الماوس مدة لا تقل عن 24 ساعة في 4 درجة مئوية. تخزين الأقطاب في درجة مئوية (4) واستخدامها على مدى فترة من 3-4 أشهر. </li></ol> 2. إعداد تجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داكنة التكيف مع الفأر بين عشية وضحاها. استخدام نوع البرية (على سبيل المثال، C57Bl / 6) الفئران لقضيب يحركها التسجيلات transretinal وα T - / - الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8 لتسجيلات مخروط transretinal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 إعداد حل نضح L، 100 مل حل الكهربائي، و 20 مل من محلول الحضانة (انظر أدناه)، وتصفية الحوض الصغير حل نضح 1 ميليبور 0.45 ميكرومتر أو 0.22 ميكرومتر مرشح (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة مصدر الضوء (505 نانومتر الصمام أو الهالوجين مشجعا مصباح ضوئي) باستخدام مضواء وضعت في الطائرة من شبكية العين. في حالة من مصدر ضوء الصمام، واستخدام الناشر البصرية لتحقيق التوحيد ضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة نضح لتجربة (غرفة المنشآت قد تختلف). يتكون لدينا من غرفة زجاجي 3 مم، مع القاع مصنوعة من غطاء طبق بتري بلاستيكية صغيرة، ويحتوي على حجم نضح نشط من ~ 400 ميكروليتر (L = 25 مم، W = 8 مم، H ≈ 2 ملم). شغل مساحة أقل الكهربائي للغرفة مع حل الكهربائي التي تحتوي على 2 مم L-الغلوتامات و 10 ملم بووتون 2. باستخدام انابيب البلاستيك والزجاج والشعرية، إجراء اتصال بين الحل في مساحة أقل قطب كهربائي (مصنوعة من توصيل الأنابيب البلاستيكية التي تعلق على أسفل غرفة) وحامل قطب كهربائي. تأكد من عدم وجود فقاعات في القطب، وأنابيب يربط، أو صاحب قطب كهربائي (تطهير حل باستخدام المحاقن البلاستيكية إذا لزم الأمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب غرفة تسجيل على مرحلة من مراحل المجهر (اختياري: يمكن تركيب المجهر على طاولة مضادة للاهتزاز ومحمية داخل قفص فاراداي للحد من الضوضاء الميكانيكية والكهرومغناطيسية). وصل صاحب أدنى القطب إلى القطب headstage إيجابي من مكبر للصوت التفاضلية (مثل الآلات وارنر DP-311 مكبر للصوت). مركز ومحاذاة القطب الغرفة السفلى فتح مع التحفيز بقعة ضوء. ربط خط نضح إلى غرفة تسجيل وتحويل نضح في. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعة الحل نضح مع 95٪ O 2 / ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في حين أن تفرخ في 40 درجة مئوية واتإيه حمام. CO 2 يضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.2. الحل ينبع من زجاجة إلى دائرة تسجيل عن طريق الجاذبية يمر المقاوم السيراميك إعادة تسخين الى 36-37 درجة مئوية. للحد من فقدان الحرارة، يجب أن يكون موجودا في سخان أقرب إلى غرفة تسجيل وقت ممكن، من الناحية المثالية على مسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع منظم تدفق ضبط معدل تدفق إلى حوالي 1 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط القطب العلوي إلى القطب (السلبية) الثاني من headstage باستخدام حامل القطب الثاني. ربط تحقيق الحرارية إلى القطب العلوي باستخدام حلقة O-. تأكد من أن نصائح القطب والحرارية هي قريبة من بعضها البعض بحيث يتم أخذ القراءة في درجة الحرارة وعلى مقربة من مركز شبكية العين ممكن. تزج غيض من القطب العلوي في حل نضح ووضعها في وسط الغرفة. تسمح 10-15 دقيقة لتحقيق الاستقرار خط الأساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط العاصمة الجهد لسخان حتى درجة حرارة الحل هو 36 -37 درجة مئوية. </li></ol> 3. عزل الشبكية ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت ضوء أحمر خافت، الموت ببطء الماوس داكنة تكيف مع CO 2 والتفكك عنق الرحم. اختياري: جعل علامة مرجعية على كل مقلة العين الماوس عن طريق الكي النقطة الأكثر الظهري للالصلبة مع القلم أو مكواة ساخنة دبوس تشريح. يتم تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام محولات صورة بالأشعة تحت الحمراء لائقا لمجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج العينين مع مقص منحني من خلال تطبيق ضغط لطيف على الجلد وتمتد على جانبي كل عين. Hemisect كلا مقل العيون تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء باستخدام microscissors أو شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرنية والعدسة. إزالة أكبر قدر من زجاجي ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الشبكية الأولى من الصباغ طبقة الظهارة، وإذا لزم الأمر، تماما تنظيفه مع ملقط لإزالة حبيبات المتبقية من الظهارة الصبغية نحن نستخدم عادة شبكية العين كلها على حد سواء قضيب وtransret مخروطإينال التسجيلات. ومع ذلك، إذا كنت ترغب في تسجيل على وجه التحديد من الجزء الظهري من شبكية العين الفأر الذي لديه أكثر M / L-المخاريط 9، قبل تقشير الشبكية إزالة جزء من بطني فنجان العين مع شفرة حلاقة أو microscissors باستخدام علامة الكي كمرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مقلة العين 2 hemisected في طبق بيتري صغير مع حل حضانة واحتضان إعداد في مربع ضوء محكم مشبع بالأكسجين النقي حتى الاستخدام. عادة، لا يمكن في ظل هذه الظروف يمكن تخزين فنجان العين الماوس الثاني لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة وتستخدم للتسجيلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج أو ماصة بلاستيكية نقل الشبكية معزولة إلى قطرة من محلول الارواء (حوالي 300 ميكرولتر) على غطاء من طبق بيتري. أضف 5-6 قطرات صغيرة من محلول يحتوي على قطب كهربائي بووتون 2 إلى شبكية العين في مرحلة ما قبل احتضان مع بووتون 2. ضع قطعة مربعة (5x5 ملم حوالي العام) من الجانب الخلفي الزاوية مدهون (نستخدم داو كورنينج مواد التشحيم 111 و صمام مانع التسرب) ورقة مرشح ميليبور (0.45 ميكرون HARG نوع) مع مسبقة الصنع ثقب في وسطها (2-2،5 ملم في القطر) إلى انخفاض حل نفسه. باستخدام ملقط موقف الشبكية على رأس ورقة الترشيح (مبصرة جانب متابعة) واضغط على أطرافها على هامش لمسطح تركيبها. يجب أن تتركز في شبكية العين خلال فتحة في ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط نقل ورقة الترشيح مع شبكية العين إلى الدائرة نضح ووضعه فوق بقعة التحفيز الانحياز مساحة أقل الكهربائي. اضغط قليلا حواف مدهون من ورقة الترشيح إلى أن السندات مع الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطب كهربائي العليا على مركز شبكية العين (لمس قليلا طبقة مستقبلة للضوء). تركز القطب العلوي على شبكية العين يزيد من سعة إشارة (تصل إلى 20-40٪ ~ بالمقارنة مع وضعه أقرب إلى حافة شبكية العين). على الرغم من أن مثل موقع القطب يشوه قليلا الحافز ضوء فعالة كثافة التوصل الى قطاع صغير من شبكية العين (~ 12-15٪ من مساحتها الكلية)، فإنه لا يزال الطريق الأمثل لوضع ELECtrode. إعداد جاهز الآن للتسجيلات transretinal. </li></ol> 4. Transretinal تسجيلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على خط الماوس الخاص بك، سجل قضيب أو M / L-مخروط يحركها ردود فلاش اختبار من خافت إلى كثافة مشرق من معايرة ضوء نانومتر 505 قدم من مصدر ضوء LED أو مشجعا بصري. في حالة لدينا مصدر ضوء الصمام، ويتم التحكم في شدة الفلاش من قبل مجموعة من الرقابة الآلية لمساهمة الجهد الصمام، والمقاومات للتحويل، ومجموعة من مرشحات الكثافة محايدة (E-نستخدم اللون # 211 0.9 مرشحات فيلم ND من مختبرات روسكو ) وضعت بين الصمام وشبكية العين و. يتم التحكم في مدة اختبار فلاش LED (20 مللي) بواسطة جهاز كمبيوتر. إذا باستخدام محفز لمبة الهالوجين بصري، يمكن التحكم اختبار كثافة الفلاش والطول الموجي من قبل مجموعة من المرشحات كثافة محايدة وضيق المرشحات تدخل الفرقة، على التوالي. يمكن التحكم اختبار فلاش مدة بواسطة الكمبيوتر يحركها مصاريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: للحفاظ على كفاءةقمع مكون من الدبقية photoresponse مع بووتون 2 على مدار اليوم، وتغيير الحل الكهربائي في بعض الأحيان أقل (على سبيل المثال قبل اختبار كل شبكية العين) عن طريق تطهير باستخدام حقنة بلاستيكية مملوءة حل جديد. </li></ol> 5. ممثل النتائج الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الماوس نضح شبكية العين: 112.5 ملي كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 2.4 مم MgCl 2، 1.2 مم CaCl 2، 10 HEPES ملم (7.2 درجة الحموضة)، و 20 ملي NaHCO 3، 3 مم نا سكسينات، 0.5 مم نا الغلوتامات، 0.02 ملم EDTA، و 10 مللى جلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، وتستكمل الحل مع 2 مم L-الغلوتامات و 10 ميكرومتر DL-AP-4 لمنع عناصر مرتبة أعلى من photoresponse 10،11، والفيتامينات مع MEM 0.1٪ و MEM الأحماض الأمينية حلول (سيجما) لتحسين شبكية العين الجدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فأر حل الكهربائي: 140 ملم كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 2.4 مم MgCl 2، 1.2 مم CaCl 2، 3 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم). الحل في الجزء الأسفل من ايلىمساحة ctrode يحتوي أيضا على 2 مم L-الغلوتامات لمنع انتقال متشابك (10) وبالإضافة إلى ذلك، 10 ملي بووتون 2 إلى قمع المكون الدبقية من photoresponse 3،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شبكية العين حل حضانة: حل 272 ملغ L-15 متوسطة (سيغما) و 20 ملغ جيش صرب البوسنة في 20 مل من الماء منزوع الأيونات. نهائي L-15 وتركيزات جيش صرب البوسنة هي 13.6 ملغ / مل و 1 ملغ / مل، على التوالي. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك 1 م. </li></ol><img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي يظهر العزلة من شبكية العين الماوس للتسجيلات ERG transretinal. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> الشكل 2. صورة لغرفة نضح وأقطاب تسجيل مع أصحابها. السهام الحمراء تشير إلى اتجاه تدفق نضح. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; الشكل 3. رسم تخطيطي لإعداد تجريبي للتسجيلات ERG transretinal. السهام الحمراء تشير إلى اتجاه تدفق نضح. <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> النتائج الممثل الشكل 4: سجلت عائلة من ردود قضيب يحركها الماوس transretinal. وكانت Photoresponses المنخفضة تمرير المصفاة في 30 هرتز (8-قطب بسل)، رقمية في 1 كيلو هرتز وتخزينها على جهاز الكمبيوتر لمزيد من التحليل. آثار أظهرت تمثل متوسطات استجابات 5-6 في شدة الضوء الخافت والاستجابات 2-3 في شدة ضوء تشبع. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> الشكل 5 نتائج الممثل: عائلة مسجل ردود مخروط يحركها الماوس transretinal. وكانت Photoresponses المنخفضة تمرير المصفاة في 30 هرتز (8-قطب بسل)، رقمية في 1 كيلو هرتز وتخزينها على جهاز الكمبيوتر لمزيد من التحليل. وأظهرت آثار averagوفاق من ردود 5-10 في شدة الضوء الخافت والاستجابات 3-5 في شدة ضوء تشبع.

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ووصف أسلوب العصا والمخروط يحركها التسجيلات ERG transretinal أعلاه أصبح أداة قوية لتحقيق وظيفة من المستقبلات الضوئية الماوس في كل نوع البرية والحيوانات المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى توصيف سهل من خصائص photoresponse الأساسية، وهذا أسلوب بسيط ويوفر استقرار كبير خلال استجابة طويلة ا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> العلوم الحيوية TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> جميع الكواشف الأخرى </td><td></td><td> سيغما الدريخ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> زجاج الشعيرات الدموية </td><td></td><td> الآلات الدقيقة العالم </td><td> TW100-4 </td><td> لصنع أقطاب كهربائية </td></tr><tr><td> مرشح ورقة </td><td> HARG </td><td> ميليبور </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> مضواء </td><td></td><td> آلات UDT </td><td> S350 </td><td> لمعايرة ضوء </td></tr><tr><td> الراديومترية السيليكون استشعار </td><td></td&gt; <td> آلات UDT </td><td> 221 </td><td> لمعايرة ضوء </td></tr><tr><td> مضادة للاهتزاز طاولة </td><td></td><td> تقنية تصنيع شركة </td><td> TMC 78-239-02R، TMC63-26012-01 </td><td> للحد من الضوضاء الميكانيكية </td></tr><tr><td> ضاغط الهواء النمر ف 15TC </td><td></td><td> يرتر الدولية </td><td> ف 15TC </td><td> متصلة مضادة للاهتزاز طاولة </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> لتشريح العين الماوس </td></tr><tr><td> محولات صورة بالأشعة تحت الحمراء </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> منضما إلى stereomicroscope </td></tr><tr><td> الفرق مكبر للصوت DP-311 </td><td></td><td> نذير الآلات </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> محور عصبي Digidata 1440A محول الأرقام </td><td>؛ </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> قناة مزدوجة 8 القطب تصفية </td><td></td><td> كرون-هايت شركة </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> السيراميك المقاوم </td><td></td><td> TE الربط </td><td> كلية الدراسات العليا SBCHE618RJ </td><td> لإعادة تسخين الحل نضح </td></tr><tr><td> المزدوجة الحرارية </td><td> تي </td><td> Physitemp الآلات </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> درجة الحرارة رصد </td><td></td><td> أوميغا </td><td> DPi32 </td><td> متصلة الحرارية </td></tr><tr><td> الصمام 505 نانومتر </td><td></td><td> TT إلكترونيات / تكنولوجيا Optek </td><td> DIGI-المفتاح P / N 365-1185-ND </td><td> لتطبيق الاختبار ومضات / ضوء تبيض </td></tr><tr><td> مكواة القلم </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> لوضع علامات على الجزء الظهريمن مقلة العين الماوس </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 الحصول على البيانات وتحليل البرامج الكهربية </td><td></td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

هناك فئتين متميزتين من الصور المكونة للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية الفقاريات: قضبان ومخاريط. قضبان هي قادرة على الكشف عن الفوتونات واحد للضوء في حين المخاريط بشكل مستمر تحت الظروف المتغيرة بسرعة الضوء الساطع. امتصاص الضوء بواسطة قضيب وأصباغ مخروط محددة البصرية في قطاعات الخارجي من المستقبلات الضوئية يتسبب في سلسلة phototransduction أن يؤدي في النهاية إلى إغلاق قنوات النوكليوتيدات بوابات دوري على غشاء البلازما وفرط الاستقطاب الخلية. ويمكن تسجيل هذا التغيير الناجم عن ضوء في غشاء الحاليين والمحتملين بمثابة photoresponse، إما عن طريق الشفط الكهربائي الكلاسيكية 1،2 تقنيات التسجيل أو عن طريق التسجيلات مخطط كهربية الشبكية transretinal (ERG) من شبكية العين معزولة مع سدت عقاقيري مكونات استجابة بعد المشبكي 3-5. الأسلوب الأخير يسمح للأدوية في متناول طويلة الأمد تسجيلات من المستقبلات الضوئية الماوس ومفيد بشكل خاص للحصول على photoresponses مستقر الابأم المخاريط الماوس نادرة وهشة. في حالة المخاريط، يمكن تنفيذ مثل هذه التجارب على حد سواء في الظروف المظلمة مكيفة والإضاءة المكثفة التالية التي التبييض أساسا جميع الصباغ البصرية، لرصد عملية الانتعاش حساسية مخروط خلال التكيف مع الظلام 6،7. في هذا الفيديو، وسوف نعرض كيفية تنفيذ قضيب وM / L-مخروط يحركها التسجيلات transretinal من الظلام تكييفها شبكية العين الماوس. وسيتم استخدام التسجيلات قضيب من شبكية العين من النوع البري (C57BL / 6) الفئران. عن البساطة، وسوف يتم الحصول على تسجيلات مخروط من transducin قضيب المعدلة وراثيا α وحدة فرعية خروج المغلوب (Tα - / -) الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8.

Watch this Scientific Journal Video about Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses at JoVE.com

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Views.  Washington University School of Medicine. ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع ?...

Video: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

تسجيلات الكهربية من الألياف المسار عملاق د. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

حيث قمت بقص المسائل: تشريح وتحليل دليل للتوجه المكاني للشبكية الماوس من معالم بصري

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

تسجيلات التخطيط الدماغي موسع من الانتقال بحرية الخنازير

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

تصور انهيار مخروط النمو محواري وأوائل آثار بيتا اميلويد في الماوس استزراع الخلايا العصبية

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video