Çok erken embriyolar bile birçok farklı sinyal molekülü içerir, bu da herhangi bir bireysel embriyonik sinyalin tam işlevini ayırt etmeyi zorlaştırır. Hücreleri endojen sinyal merkezlerinden izole ederek, bu eksplantlar araştırmacıların belirli bir sinyal molekülünün göreceli izolasyondaki rolünü incelemelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, kök hücreleri kültürde korumak için gereken zaman veya çaba olmadan basitleştirilmiş bir ex-vivo sistemi içinde embriyonik zamanlamayı, hücre hareketlerini ve gen ekspresyon kalıplarını yeniden yakalayabilmemizdir.
Önce enfekte olmayan embriyolardan eksplantları keserek başlayın. Kültür genişleten eksplantlar ise, kesim yumurta sarısına yakın olacak şekilde yapıldı. Çekilmiş bir cam kılcal iğneyi RNA ile doldurarak başlayın.
Doldurulmuş iğneyi bir mikro manipülatöre yerleştirin ve iğnenin ucunups ile kırın. Enjeksiyon hacmini bir damla mineral yağ ile bir sahne mikrometresi kullanarak kalibre edin, enjeksiyon süresini ve pnömatik enjektör üzerindeki basıncı ayarlayarak istenen boyutta bir bolus elde edin. RNA iğne ucunu enjekte etmeye hazır olana kadar yağa batırın.
Embriyoları pasteur pipet ve pipet pompası kullanarak enjeksiyon plakasına yükleyin ve ardından yumurtaları oluklara hafifçe bastırmak için eldivenli bir parmak kullanın. İstenilen embriyo sayısına ulaşılana veya embriyolar bölünmeye başlayana kadar tek hücreli embriyoların sarısına 10 pikogram ndr2 RNA enjekte edin. Embriyoları enjeksiyon plakasından etiketli bir Petri kabına yıkamak için bir sıkma şişesinden hafif bir yumurta suyu akışı kullanın.
Embriyoları 128 hücre aşamasına ulaşana kadar 28,5 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Kısırlaştırılmamış yumurtaları ve ölü embriyoları tabaktan çıkarın. Embriyolar 128 hücre aşamasına ulaştıktan sonra, onları etiketli cam Petri tabaklarına yerleştirin ve onlardan mümkün olduğunca fazla yumurta suyu demlendirin.
Cam kristalize tabakları küçük tabak isimlerine karşılık gelen laboratuvar bandı ile etiketleyin ve üçte ikisini yumurta suyu ile doldurun. Hızlı erişilebilirlik için bu yemekleri diseksiyon mikroskoplarının yanına yerleştirin. Mililitre pronaz stoğu başına bir mililitre 20 miligram ekleyin, buz üzerinde çözünerek 50 mililitrelik konik bir tüpte 3X Danieau çözeltisinin 15 mililitresine çözün.
Embriyo içeren her cam Petri kabına en az beş mililitre pronaz çözeltisi ekleyin. Cam tabakları dairesel bir hareketle çalkalayarak, diseksiyon mikroskobu altında sürekli olarak dekonsiyonun ilerlemesini takip edin. Korozyonlar kırışmaya başladığında ve bir ila iki embriyo koroyonlarından çıktıktan sonra, pronaz içeren cam Petri kabını ve embriyoları yumurta suyu içeren ilgili cam kristalize kabın içine dikkatlice batırın.
Kafeinsizlik embriyolarını yumurta suyu ile üç kez yıkayın ve yumurta suyunu tabaktan demle edin. Üçüncü ve son yıkamayı 0.3X Danieau'nun çözümüyle gerçekleştirin. Dekonsiyone embriyoları bir Petri kabı kapağı ile örtün ve 256 hücreli aşamaya ulaşana kadar 28,5 santigrat derecede inkübatöre geri verin.
Agarose kaplı petri kabını 3X Danieau'nun çözeltisiyle doldurun. Embriyolar 256 hücreli aşamaya geçtikten sonra, onları 3X Danieau çözeltisi içeren agarose kaplı plakaya aktarın ve yemeğin merkezi boyunca sıralayın. Embriyoyu stabilize etmek için kapalı tutulan bir çift torpil kullanın ve diğerini blastoderm'i kesmek için kullanın.
Kesmek için, blastoderm hücrelerini bir çift önps ile hafifçe sıkın, ardından stabilize edici torplapları alın ve blastoderm boyunca yaklaşık olarak yarıya kadar dilimlemek için diğer önps boyunca çalıştırın. Embriyoyu döndürün, torplatı mevcut kesime yerleştirin ve kalan blastoderm ortogonal'ı ilk kesime kesin. Eksplantları iyileştirmek için 3X Danieau'nun çözeltisinde en az beş dakika tutun ve ardından dört mililitre eksplant ortamla dolu altı kuyulu bir plakanın agarose kaplı kuyusuna aktarın.
Explant kültür plakalarını istenen zaman noktasına veya aşamaya ulaşılana kadar 28,5 santigrat derecelik inkübatöre yerleştirin. Kimerik eksplantları kesmek için, bir milimetre cam boncuk kullanarak 12 küçük sığ kuyuya kalıplanmış agarose içeren bir tabak kullanın. Tabağı 3X Danieau'nun çözeltisiyle doldurun.
Plakanın sol tarafına bir genotip veya durumdan 12 embriyo ekleyerek hazırlanın ve diğer genotipin 12 embriyosu plakanın sağ tarafına koşullandırılmıştır. Her durumdan bir embriyoyu 12 kuyudan birinin yakınındaki plakanın ortasına taşıyın. Forseps kullanarak, tek embriyo eksplantları için açıklandığı gibi her embriyodan bir eksplant kesin.
İki yarının tek bir eksplant halinde birlikte iyileşmesini sağlamak için iki dışlayıcının kesilmiş kenarlarını sığ kuyuda hızlı bir şekilde bastırın. Plakanın içindeki kalan 12 kuyu ile devam edin. Eksplantlar iyileştikten sonra, dört mililitrelik eksiz ortamla dolu altı kuyulu bir plakanın agarose kaplı kuyusuna aktarın.
İstenilen sayıda eksplant elde edilene kadar tekrarlayın. Sağlam kardeş embriyoları istenen aşamaya gelene kadar kültür 28,5 santigrat santigrat derece inkübatörde eksplante eder. Enfekte olmayan vahşi tip embriyolardan veya yeşil floresan proteini kodlayan 50 pikogram enjekte edilen eksplantları kontrol etmek kültür dönemi boyunca yuvarlak kaldı ve mezoderm, endoderm veya nöroektoderm belirteçlerini ifade edemedi.
Ndr2 mRNA'nın 10 pikogramı ile enjekte edilen embriyolardan kesilen eksplantlar, kültürde sekiz ila dokuz saat sonra oldukça uzadı. Bu eksplantların diferansiyel müdahale kontrast mikroskopisi ile canlı zaman atlamalı görüntülenmesi, uzatmanın döllenme sonrası sekiz saat veya yaklaşık sekiz saatte arttığını ortaya koydu. Ndr2'nin 10 pikogramı ile enjekte edilen embriyolardan elde edilen eksplantlar mezoderm belirteçleri, tbxta, noto, tbx16 ve nöroektoderm belirteci sox2'nin sağlam ifadesini gösterdi.
Eksplantların embriyonik marjın çok üzerinde kesilmesi çok önemlidir. Aksi takdirde, eksplantlar marjdan endojen sinyaller içerecek ve naif olmayacaktır. Bu yöntemde gastrülasyon morfogenezinde nodal sinyalizasyonun rolünü ele almak için eksplantlar kullanılmıştır.
Gelecekte, diğer araştırmacılar bu yaklaşımı, örneğin herhangi bir sayıda gelişimsel süreçte ek sinyal moleküllerinin rolünü test etmek için kullanabilirler.
