אפילו עוברים מוקדמים מאוד מכילים מולקולות איתות רבות ושונות, מה שיכול להפוך את זה למאתגר להבחין בתפקוד המלא של כל אות עוברי בודד. על ידי בידוד תאים ממרכזי איתות אנדוגניים, explants אלה מאפשרים לחוקרים לבחון את תפקידה של מולקולת איתות נתונה בבידוד יחסי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מסוגלים לשחזר תזמון עוברי, תנועות תאים, ודפוסי ביטוי גנים בתוך מערכת ex-vivo פשוטה ללא הזמן או המאמץ הנדרש כדי לשמור על תאי גזע בתרבות.
התחל על ידי חיתוך explants מן העוברים נגועים הראשון. אם explants הרחבת תרבות, אז החתך נעשה כדי לסגור את החלמון. התחל על ידי מילוי מחט נימי זכוכית משך עם RNA.
מניחים את המחט המלאה לתוך מיקרו-מניפולטור ולשבור את קצה המחט עם המלקחיים. כייל נפח הזרקה באמצעות מיקרומטר שלב עם טיפה של שמן מינרלי, התאמת זמן הזרקה ולחץ על מזרק פנאומטי כדי להשיג בולוס של הגודל הרצוי. שמור את קצה מחט הרנ"א שקוע בשמן עד מוכן להזרקה.
טען את העוברים לתוך צלחת ההזרקה באמצעות פיפטה פסטר ומשאבת פיפטה, ולאחר מכן להשתמש באצבע כפפות ללחוץ על הביצים לתוך שוקת בעדינות. הזריקו 10 פיקוגרמות ndr2 RNA לחלמון של עוברים חד-תאיים עד להגעה למספר העוברים הרצוי או עד שהעוברים מתחילים להתחלק. השתמש בזרם עדין של מי ביצים מבקבוק סחיטה כדי לשטוף את העוברים מתוך צלחת ההזרקה לתוך צלחת פטרי שכותרתו.
מניחים את העוברים לתוך אינקובטור 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו לשלב 128 התא. מוציאים מהמנה ביצים לא מופרות ועוברים מתים. לאחר שהעוברים הגיעו לשלב 128 התאים, הניחו אותם בצלחות פטרי מזכוכית מסומנות, וקבעו מהם כמה שיותר מי ביצים.
תוויית כלים מתגבשים מזכוכית עם סרט מעבדה המתאים לשמות כלים קטנים, ומלאו שני שליש מהדרך במי ביצים. הניחו את הכלים האלה ליד המיקרוסקופ הניתח לנגישות מהירה. הוסף מיליליטר אחד של 20 מיליגרם למלאי פרונאז מיליליטר, מופשר על קרח ל 15 מיליליטר של פתרון 3X Danieau בצינור חרוט 50 מיליליטר.
מוסיפים לפחות חמישה מיליליטר של תמיסת פרונאז לכל צלחת פטרי המכילה עוברים. להסעיר את מנות הזכוכית בתנועה מעגלית, ניטור ההתקדמות של dechorionation בעקביות תחת מיקרוסקופ מנתח. ברגע שה chorions מתחילים להתקמט ואחד עד שני עוברים הם מתוך chorions שלהם, בזהירות להטביע את צלחת פטרי המכיל פרונאז ואת העוברים לתוך צלחת התגבשות זכוכית המקבילה המכילה מי ביצה.
לשטוף את העוברים dechorionation שלוש פעמים עם מי ביצה decant את מי הביצה מן המנה. בצע את הכביסה השלישית והאחרונה עם פתרון 0.3X של דניאו. מכסים את העוברים המומתנים במכסה צלחת פטרי, ומחזירים אותם לאינקובטור ב-28.5 מעלות צלזיוס עד שהגיעו לשלב 256 התאים.
מלאו צלחת פטרי מצופה אגרוז עם פתרון 3X Danieau. לאחר העוברים נמצאים בשלב 256 תאים, להעביר אותם לתוך מצופה אגרוז המכיל את הפתרון של 3X Danieau, בשורה אותם לאורך מרכז המנה. השתמש זוג אחד של מלקחיים, החזיק סגור כדי לייצב את העובר, ולהשתמש השני כדי לחתוך את blastoderm.
כדי לחתוך, לסחוט בעדינות את תאי blastoderm עם זוג אחד של מלקחיים, ולאחר מכן לקחת את המלקחיים המייצבים ולהפעיל אותם לאורך המלקחיים האחרים לפרוס בערך באמצע הדרך על פני blastoderm. לסובב את העובר, הצבת המלקחיים לתוך החתך הקיים ולאחר מכן לנתק את האורתוגונל blastoderm הנותר לחתך הראשון. שמור explants בפתרון של 3X Danieau לפחות חמש דקות כדי לרפא, ולאחר מכן להעביר אותם לאגורוז מצופה היטב של צלחת שש באר מלא ארבעה מיליליטר של מדיה explant.
מניחים את לוחות התרבות המהוללים לתוך החממה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לנקודת הזמן או הבמה הרצויה. כדי לחתוך את explants כימרי, להשתמש בצלחת עם agarose יצוק לתוך 12 בארות רדודות קטנות באמצעות חרוזי זכוכית מילימטר אחד. מלא את הרמה עם פתרון 3X Danieau.
היכונו על ידי הוספת 12 עוברים של גנוטיפ אחד או מצב בצד שמאל של הצלחת, ו -12 עוברים של הגנוטיפ השני מותנים בצד ימין של הצלחת. מעבירים עובר אחד מכל תנאי למרכז הצלחת ליד אחת מ-12 הבארות. באמצעות מלקחיים, לחתוך explant מכל עובר כמתואר עבור explants עובר יחיד.
לחץ במהירות על הקצוות החתוכים של שני explants יחד בתוך הבאר הרדודה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר לשני החצאים לרפא יחד לתוך explant אחד. ממשיכים עם 12 הבארות הנותרות בתוך הצלחת. לאחר שההסברים נרפאים, העבירו אותם לבאר מצופה אגרוז של צלחת ששת בארות מלאה בארבעה מיליליטר של מדיה מסבירה.
חזור על הפעולה עד שהמספר הרצוי של explants מושגת. תרבות explants בחממה 28.5 מעלות צלזיוס עד עוברים אחים שלמים הגיעו לשלב הרצוי. שליטה explants לחתוך מן העוברים מסוג בר נגוע או אלה מוזרק עם 50 פיקוגרמות של חלבון פלואורסצנטי ירוק mRNA נשאר מעוגל לאורך כל תקופת התרבות, ולא הצליח לבטא סמנים של mesoderm, אנדודרם, או neuroectoderm.
Explants לחתוך עוברים מוזרק עם 10 פיקוגרמות של ndr2 mRNA הפך מוארך מאוד לאחר שמונה עד תשע שעות בתרבות. הדמיה חיה של explants אלה על ידי מיקרוסקופיה ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית גילתה כי ההרחבה הוצאה בערך שמונה שעות לאחר ההפריה. Explants מן העוברים מוזרק עם 10 פיקוגרמות של ndr2 הציג ביטוי חזק של סמני mesoderm, tbxta, noto, tbx16, ואת סמן neuroectoderm sox2.
חשוב מאוד לחתוך את explants הרבה מעל השוליים העובריים. אחרת, explants יכיל אותות אנדוגני מן השוליים ולא להיות נאיבי. בשיטה זו, explants שימשו כדי לטפל בתפקיד של איתות nodal מורפוגנזה גסטרולציה.
בעתיד, חוקרים אחרים יכולים להשתמש בגישה זו כדי לבדוק את התפקיד של מולקולות איתות נוספות, למשל, בכל מספר של תהליכים התפתחותיים.
