الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار تكامل ثلاثة أنظمة تصوير في جهاز واحد ، مما يتيح قياسا متزامنا للوظيفة الميكانيكية ، والديناميكيات الأيونية ، والتغيير الهندسي لأنسجة القلب المتعاقدة. على وجه التحديد، نحن نقيس إنتاج قوة الأنسجة، والعابلي الكالسيوم، والتشريد المحلي، وتغيير الشكل. ويمكن أن يساعد الجمع بين طرائق التصوير هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض القلب، مع ما يترتب على ذلك من آثار كبيرة على وضع استراتيجيات علاجية فعالة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكننا من دراسة عدم التجانس في نشاط العضلات. يحتوي الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول على ثلاثة أنظمة تصوير قادرة على تصوير نفس العينة، ومجهر برايتفيلد، ومجهر مضان، وتصوير مقطعي للتماسك البصري. وتستخدم سلسلة من المرايا ديكهروي لفصل انبعاث مضان وصورة انتقال برايتفيلد.
السمات الأساسية لهذا الجهاز هما خطاطيف تصاعد مستقلة المحركة، وغرفة قياس مع ثلاثة محاور واضحة بصريا وخط الزناد الخارجي الذي يتزامن مع كاميرات brightfield وOCD مع محفز. في هذا الفيديو، ونحن نبين كيفية عزل وإعداد وصورة ترابيكولا القلب وتقديم بعض النتائج التمثيلية. بعد استئصال قلب من جرذ مخدر، قم بنقله إلى غرفة التشريح.
باستخدام اثنين من ملقط منحني، سحب الشريان الأورطي على قنية التغلغل. عقد الشريان الأورطي في مكان مع ملقى واحد. وفي الوقت نفسه، افتح خط الأنابيب للسماح حل تشريح لتدفق من خلال قنية التخبط.
بمجرد تطهير الأوعية التاجية من الدم وثقب القلب تماما بمحلول التشريح ، قم بتأمين الشريان الأورطي في مكانه باستخدام خياطة. ضع القلب عن طريق تدوير القنية بحيث يكون الشريان التاجي الأيسر مرئيا على السطح المتفوق. دبوس قمة القلب إلى الجزء السفلي من غرفة تشريح.
قطع كل من الأذينين. قطع على طول الجانب الأيمن من الحاجز إلى قمة القلب. تثبيت البطين الأيسر فتح إلى قاعدة غرفة تشريح.
ثم، وقطع على طول الجانب الأيسر من الحاجز، وفتح البطين الأيمن ودبوس عليه إلى قاعدة غرفة تشريح، أيضا. تحديد trabecula حرة التشغيل في البطين الأيمن. باستخدام مقص الربيع والملقط، وقطع أنسجة الجدار المحيطة trabecula.
ثم، وقطع نسيج الجدار في النصف، متعامدة إلى اتجاه trabecula. تقليم أنسجة الجدار حتى بعدها هو المناسب لتكوين تصاعد المستخدمة. اترك التراكيكولا المقتطعة في غرفة التشريح.
تدفق الماء الساخن، والمياه المقطرة، ومن ثم حل superfusate من خلال غرفة القياس. قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر الساطع واضغط على F1 لتمكين الالتقاط. ضبط خطاف المصب يدويا حتى يتم توسيطه في صورة brightfield.
انقر فوق محور المصب صفر، ثم تعطيل المصب لتمكين المحرك. حرك شريط تمرير نقطة تعيين المتلقين للمعلومات حتى محاذاة نهاية الخطاف مع حافة منطقة الاهتمام الافتراضية. أعد صفر محور المصب، ثم حرك شريط تمرير نقطة تعيين المصب إلى 1,000.
كرر العملية باستخدام ربط upstream ولكن لا نقل شريط التمرير نقطة تعيين upstream بعد إعادة التصفير محور upstream. انقر فوق الانتقال إلى التركيب. ابدأ نظام الإضاءة الفلورية عن طريق تبديل مفتاح المصباح قبل تشغيل النظم الفرعية لوحدة التحكم بسرعة عن طريق تبديل المفتاح الرئيسي.
قم بتبديل الوضع التشغيلي إلى فراغ توربو بالضغط على زر الوضع على اللوحة الأمامية، يليه اثنان، ثم واحد. اضغط على زر الاتصال لتمكين التحكم الخارجي. وقفة تدفق فائقة من خلال غرفة القياس.
ملء غرفة تصاعد مع حل تشريح. باستخدام حقنة مليلتر واحد، نقل trabecula من غرفة تشريح إلى غرفة تصاعد. السماح لtrabecula النزول إلى غرفة تصاعد عن طريق الجاذبية.
خفض مستوى السوائل في غرفة التركيب بحيث يكون مستوى مع القسم الأوسط من السنانير. ضبط المسافة بين السنانير لتعكس طول فترة سماح من trabecula عن طريق تحريك شريط التمرير نقطة تعيين المصب. باستخدام المجهر للمساعدة في التصور ، قبضة طفيفة واحدة من قطعة من الأنسجة نهاية مع ملقط وجبل على هوك المنبع.
جبل قطعة أخرى من الأنسجة نهاية على هوك المصب. مرة واحدة شنت بشكل آمن، ونقل trabecula مرة أخرى إلى غرفة القياس عن طريق الضغط على الانتقال إلى الغرفة واستئناف تدفق فائقة. تعيين وتيرة التحفيز إلى واحد، ومدة التحفيز إلى 10، والجهد التحفيز إلى 10.
بدء التحفيز عن طريق الضغط على التحفيز. تشغيل نظام الإضاءة برايتفيلد. اضغط F1 وحدد منطقة الفائدة التي تحيط منطقة المخططات من واجهة المستخدم.
انقر فوق حساب طول الساركومير لحساب متوسط طول الساركومير في المنطقة المميزة. زيادة طول العضلات حتى متوسط طول الساركومير هو ما يقرب من 2.32 ميكرون. حرك العضلة عن طريق ضبط شريط تمرير نقطة الوسط على علامة التبويب التحكم في الوسط والفصل بحيث تكون حافة خطاف المصب مرئية فقط داخل صورة brightfield.
جمع المعلومات الفلورية ل10 الارتعاشات. زيادة قيمة نقطة تعيين المركز بمقدار 200 وجمع آخر 10 الارتعاشات قيمتها من المعلومات الفلورية. كرر هذه العملية حتى تحتوي الصورة brightfield على خطاف المنبع.
جمع قيمة النافذة النهائية من المعلومات الفلورية. إرجاع trabecula إلى موضع مركزي عن طريق تعيين قيمة نقطة تعيين الوسط إلى صفر. خفض وتيرة التحفيز إلى 0.2 هيرتز والتحول من قوة K-H الفائقة إلى محلول التحميل Fura-2.
قياس إشارة الفلورسينس كل 10 دقائق. تصور الإشارة على علامة التبويب إشارة PMT. بعد زيادة إشارة نانومتر 360 بعامل 10 ، أعد تردد التحفيز إلى هيرتز واحد وارجع إلى محلول K-H الفائق.
تحقق من قياس النسبة كل 10 دقائق حتى تستقر الإشارة ، وعند هذه النقطة ، يمكن أن يبدأ جمع البيانات. إعادة العضلات إلى الموقف حيث حافة هوك المصب هو مجرد وجود داخل صورة brightfield. التقاط معلومات الفلورسينس بالنقر فوق تمكين مصدر الفلورسينس.
بدء تشغيل بيانات الأجهزة المتدفقة. على واجهة مستخدم التصوير brightfield، قم بتعيين وضع الالتقاط إلى مشغل خارجي، وزيادة معدل الإطار إلى 100 هيرتز، وتعيين عدد الصور لالتقاط إلى 100. اضغط على التحكم-shift-S، متبوعا F1، لتسجيل بيانات التصوير في الحقول الساطعة لهذه النافذة.
قم بزيادة قيمة نقطة تعيين الوسط بمقدار 200 وكرر عملية التقاط brightfield. استمر في استخدام بروتوكول المسح الضوئي حتى يتم جمع بيانات التصوير للنافذة النهائية. إرجاع trabecula إلى موضع مركزي عن طريق تعيين قيمة نقطة تعيين الوسط إلى صفر.
قم بتشغيل مصدر إضاءة OCT عن طريق تشغيل المفتاح الرئيسي، والضغط على زر الطاقة، متبوعا بزر SLDs. تغطية رئيس galvanometer وانقر الحصول على خلفية لقياس نمط التداخل الخلفية وطرحه من القياس. تعيين وضع التقاط الصورة إلى طريقة العرض المباشر.
قم بمركز الترابيكولا في محاور X و Y عن طريق ضبط قيم الإزاحة X و Y. مع توسيط trabecula، تفحص على طول المحور ص عن طريق ضبط موقف Y للعثور على المواقف المقابلة لالفوام والمصب السنانير. لاحظ هذه المواقف لأسفل.
تعيين النطاق Y إلى الفرق المطلق بين هذه القيم مقسوما على 10. تعيين وضع التقاط الصورة إلى التحفيز أثار، مجموعة X إلى 100، وانقر على زر تعيين المعلمات النشطة. انقر فوق دفق البيانات، ثم الحصول على.
من أجل التقاط الكالسيوم الإقليمي ومعلومات برايتفيلد لكامل طول trabecula المعروضة هنا، كانت هناك حاجة إلى سبعة مواقف العضلات. ويشير هذا الرقم للقوة المتوسطة من كل موقع من المواقع المتراكبة إلى أن قوة الارتعاش لم تزعجها هذه الحركة، مما يكشف عن عدم وجود اعتماد على موقف فعل إنتاج القوة. تم تقسيم هذه الاشعة التي تم جمعها باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري بمعدل 100 هيرتز باستخدام البرنامج المساعد ImageJ ، ويكا.
كل مقطع عرضي يبدو مشوها بسبب الفرق بين الدقة الجانبية والدقة العمق. تم تصحيح ذلك عن طريق قياس كل محور بشكل مستقل مع الدقة الخاصة به. بعد تحجيم الخام C-مسح ترابيكولا, العضلات أسطواني تقريبا.
انعكاس جدار غرفة القياس يمكن أن تتداخل في بعض الأحيان مع بيانات العضلات، ولكن يمكن تدريب برنامج تجزئة لحساب هذا. مرة واحدة مجزأة، يمكن حساب المنطقة المقطعية على طول العضلات في جميع أنحاء نشل. لاحظ أن هذا ترابيكولا خاصة لديه فرع صغير.
حركة الفرع واضحة في منتصف الطريق تقريبا على طول trabecula. وأخيرا، يمكن تحويل الصور المجزأة إلى شبكات للمساعدة في بناء نماذج هندسية. تم خياطة بيانات التصوير التي تم التقاطها في كل من المواقع السبعة بمعدل 100 إطار في الثانية معا لإنشاء صورة كاملة واحدة من trabecula.
ترتبط نسبة الفلورسينس المحذوفة المرتبطة بضوء الإثارة 340 و 380 نانومتر بالكالسيوم داخل الخلايا بعد تحميل الترابيكولا ب Fura-2. يتم محاذاة متوسط 10 عابري الكالسيوم داخل الخلايا من كل نافذة مع المنطقة التي تم تصويرها. في حين أن ذروة العابرين لهذا trabecula تبدو متسقة إلى حد معقول، والكالسيوم الانبساطي خفضت على طولها.
وبالمثل، تشير نتائج عمليات تتبع التشرد وحساب طول الساركومير أيضا إلى وجود تباين إقليمي. تقنية التتبع بدون علامات المستخدمة قادرة على حساب إزاحة كل بكسل. تم اختبار مدى ملاءمة تقديرات طول الساركومير على أساس عرض وسعة الغاوسي المناسب لإشارة FFT.
لم يتم استيفاء هذه الشروط في منطقة العضلات بين صفر و 500 ميكرون ، لذلك لا يمكن حساب أي معلومات طول الساركومير هناك. وبالنظر إلى التهجيرات المرتبطة بها، فمن المرجح أن الساركومير في هذه المنطقة ممدود خلال مرحلة الانكماش من الارتعاش. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل ترابيكولا القلب وإعدادها للتصوير متعدد الوسائط بشكل موثوق.
هذه العملية يؤسس مسارا لجمع مجموعة البيانات اللازمة لبناء نماذج عنصر محدود علم فسيولوجي من تقلص الأنسجة القلبية.
