في الآونة الأخيرة، وقد جذبت keratinocytes عن طريق الفم الانتباه بسبب ممتلكاتهم فريدة من نوعها. نحن نقدم بروتوكولا لزراعة الخلايا الكيراتينية الفموية الماوس في حالة تشبه الخلايا الجذعية مناسبة لتطبيقات المصب. ثقافة الماوس الكيراتينية عن طريق الفم وخصائص مختلفة من keratinocyte الجلد.
في هذا البروتوكول، قمنا بنجاح عزل الخلايا القرنية الفموية الماوس الأولية وتطوير تقنية الثقافة على المدى الطويل. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي في المقايسات الجزيئية والبيوكيميائية لزيادة فهم ميزة الخلايا الجذعية الباسيلار الفموية والأمراض المرتبطة بها. بعد التضحية بفأر C57BLK6J بالغ، قم بإزالة الشعر حول الفم باستخدام ماكينة حلاقة واستخدام مقص، وقطع من الخدين نحو الفك على كلا الجانبين.
بعد ذلك ، استخدم ملقط لفتح الفم على مصراعيه وامتصاص أي دم باستخدام مسحة قطنية ، ثم تطهير اللوحة عن طريق مسح داخل الفم بمسحة قطنية تحتوي على 10٪ من اليود povidone. لحصاد لوحة الماوس، أولا باستخدام شفرة مشرط الجراحية، وجعل شق هامشي سمك كامل على طول الجانب لوحة من الأسنان الفك العلوي. ثم باستخدام raspatorium، تشريح بعناية لوحة كاملة.
نقل بسرعة الأنسجة لوحة إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليلتر من المتوسطة كاملة تكملها المضادات الحيوية ومضادات العضلات. إبقاء الأنسجة على الجليد حتى تصبح جاهزة للحضانة. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، نقل الأنسجة إلى طبق 60 ملليمتر تحتوي على أربعة ملليلترات من المتوسط الكامل مع المضادات الحيوية ومضادات العضلات.
ثم باستخدام ملقط حاد قصير وشفرة مشرط، وإزالة بلطف أي دم من الأنسجة وغسل الأنسجة 10 مرات مع المتوسطة كاملة. بعد الغسيل الأخير، نقل الأنسجة إلى طبق 35 ملليمتر تحتوي على أربعة ملليلتر من 0.025٪ تريبسين تكملها المضادات الحيوية ومضادات العضلات. ضع الأنسجة مع السطح الظهاري المواجه لأسفل واحتضانها لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الثقافي.
بعد الهضم بين عشية وضحاها التربسين، استخدم زوج واحد من ملقط حادة لإزالة الأنسجة من محلول تريبسين ونقله إلى طبق 60 ملليمتر يحتوي على محلول مثبط التربسين مع سطح الظهارية التي تواجه. بعد ذلك ، التمسك بحافة اللوحة مع ملقط ، استخدم شفرة المشرط لكشط الطبقة الظهارية بلطف من البربريا الصفيحة الأساسية. لجمع أكبر قدر ممكن من الخلايا الظهارية من الأنسجة، نقل الأنسجة إلى طبق آخر 60 ملليمتر مع أربعة ملليلتر من المتوسطة كاملة وتكرار كشط كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك، ضع مصفاة خلية معقمة 100 ميكرون فوق أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. وباستخدام ماصة معقمة، نقل اثنين من ملليلتر من محلول التربسين في مصفاة لتبلل سطحه. ثم باستخدام ماصة، مزيج تعليق الخلية في طبق 60 ملليمتر عدة مرات وتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون.
لحساب عدد الخلايا، أضف 15 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق، ثم نقل 10 ميكرولترات من مزيج تريبان الأزرق الخلية إلى مقياس الدم وعدد الخلايا. بعد ذلك، طرد تعليق الخلية، وإزالة supernatant وإضافة اثنين من ملليلتر من المتوسطة كاملة تحتوي على Chelex FBS إلى الأنبوب. Resuspend بيليه الخلية عن طريق titrating عدة مرات باستخدام ماصة خمسة ملليلتر.
ثم لوحة 2-5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة من فأر واحد إلى بئر واحد من 24 جيدا لوحة المغلفة مسبقا مع نوع الكولاجين واحد واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة يومين دون تغيير المتوسطة. نمت الخلايا القرنية الفموية الأولية كطاجنة واحدة وعرضت مورفولوجيا مرصوفة بالحصى. كانت مستعمرات الكيراتينوسيت الصغيرة مرئية بعد ثلاثة وخمسة أيام.
بعد أسبوع واحد من الحضانة، نمت هذه المستعمرات أكبر وشكلت مستعمرات ضيقة. تم تنفيذ المقطع الأول بعد أسبوعين من الطلاء الأولي وفي مقاطع لاحقة ، أظهرت الخلايا القرنية نموا مستقرا مع فترة أقصر من الثقافة. توقفت الخلايا الكيراتينية عن النمو إذا حدث تلوث كبير بالخلايا الليفية أثناء عملية العزل.
بعد زراعة الخلايا الكيراتينية، عبرت عن الكيراتين 14 وألفا6-إنتيجرين. وأظهرت خلايا المرور المبكر والمتأخر تعبيرا موحدا عن P63 يؤكد جذعها. ومع ذلك، أظهرت الخلايا القرنية المعالجة بالكالسيوم العالي تناقص التعبير P63 مما يشير إلى أن العلاج عالي الكالسيوم يقمع الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية.
وأظهرت علامة التمايز الكيراتين 13 نادرة أو معدومة التعبير في الممرات المبكرة والمتأخرة، ولكن تعبيرا هاما في علاج الكالسيوم عالية. لم يتم التعبير عن علامة الخلايا الليفية PDGFR ألفا في ثقافة الخلايا القرنية مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يعزل بنجاح الخلايا القرنية القاعدية والحفاظ على هذه الخلايا في الحالة غير المتمايزة. يجب أن يبدأ المحاصرة من الجانب فوق الجافية و 10 دقيقة لكل عينة من الأنسجة.
عموما أيضا، pipetting من الخلايا مهم لتحسين قدرة الخلية على البقاء. بعد مرور اثنين أو ثلاثة، يصبح الكيراتينية الفموية مستقرة لإجراء المزيد من التجارب الوظيفية. الأهم من ذلك، يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع حياة الماوس المعدلة وراثيا لل المقايسة الخلوية والجزيئية في المختبر.
وقد أبلغت دراسة حديثة عن ديناميات وتغايرية الخلايا الجذعية باسيلار عن طريق الفم. هذه الطريقة سوف تسهل دراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية عن طريق الفم ويؤدي إلى فهم أفضل لأمراض الفم.
