В последнее время оральные кератиноциты привлекают внимание из-за своего уникального свойства. Мы предоставляем протокол для культивирования пероральных кератиноцитов мышей в состоянии, подобном стволовым клеткам, подходящем для последующих применений. Культура мышиного перорального кератиноцита отличается характерной для кожи кератиноцитом.
В этом протоколе мы успешно выделили первичный мышиный оральный кератиноцит и разработали метод долгосрочного культивирования. Эта культуральная система может быть использована в молекулярных и биохимических анализах для дальнейшего понимания особенностей пероральных базилярных стволовых клеток и связанных с ними заболеваний. Пожертвовав взрослой мышью C57BLK6J, удалите волосы вокруг рта бритвой и ножницами, срезав щеки по направлению к челюсти с обеих сторон.
Затем используйте щипцы, чтобы широко открыть рот и впитать любую кровь с помощью ватного тампона, затем продезинфицируйте палитру, протирая внутреннюю часть рта валопчатобумажным тампоном, содержащим 10% повидонового йода. Чтобы собрать урожай мышиной палитры, сначала используя хирургическое лезвие скальпеля, сделайте по всей толщине краевой разрез вдоль палитры стороны верхнечелюстных зубов. Затем с помощью распатория тщательно рассекните всю палитру.
Быстро перенесите ткань палитры в 15-миллилитровую трубку, содержащую четыре миллилитра полной среды, дополненной антибиотиками и антимикотиками. Держите ткани на льду до готовности к инкубации. В ламинарной вытяжке перенесите ткани в 60-миллиметровую посуду, содержащую четыре миллилитра полной среды с антибиотиками и антимикотиками.
Затем, используя короткие тупые щипцы и лезвие скальпеля, аккуратно удалите любую кровь из тканей и промыть ткани 10 раз полной средой. После последней стирки переложите салфетки в 35-миллиметровую посуду, содержащую четыре миллилитра 0,025% трипсина, дополненную антибиотиками и антимикотиками. Поместите ткани эпителиальной поверхностью лицом вниз и инкубируйте их в течение 16 часов при комнатной температуре в культуральной вытяжке.
После ночного переваривания трипсина используйте одну пару тупых щипцов, чтобы удалить ткань из раствора трипсина и перенести ее в 60-миллиметровую чашку, содержащую раствор ингибитора трипсина с эпителиальной поверхностью, обращенной вверх. Затем, держась за край палитры щипцами, используйте лезвие скальпеля, чтобы аккуратно соскоблить эпителиальный слой с нижележащей ламины проприи. Чтобы собрать максимальное количество эпителиальных клеток из тканей, перенесите ткань в другую 60-миллиметровую чашку с четырьмя миллилитрами полной среды и повторите соскоб, как показано ранее.
Затем поместите стерильный 100-микронный клеточный ситечко поверх конической трубки объемом 50 миллилитров. И с помощью стерильной пипетки переложить два миллилитра раствора трипсина в ситечко, чтобы намочить его поверхность. Затем, используя пипетку, смешайте клеточную суспензию в 60-миллиметровой чашке несколько раз и отфильтруйте клетки через 100-микронный клеточный сетчатый фильтр.
Чтобы подсчитать количество клеток, добавляют 15 микролитров клеточной суспензии к 50 микролитрам раствора трипан синего цвета, затем перекладывают 10 микролитров ячейки трипан синей смеси на гемоцитометр и подсчитывают количество клеток. Затем центрифугируют клеточную суспензию, удаляют надосадочный агент и добавляют в трубку два миллилитра полной среды, содержащей Chelex FBS. Повторное суспендирование клеточной гранулы путем титрования несколько раз с использованием пятимиллилитровой пипетки.
Затем пластинчат от двух до пяти раз по 10-пятую клетки от одной мыши в одну лунку из 24-луночной пластины, предварительно покрытой коллагеном первого типа, и инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение двух дней без изменения среды. Первичные оральные кератиноциты росли как монослой и демонстрировали морфологию булыжника. Небольшие колонии кератиноцитов были видны через три и пять дней.
После одной недели инкубации эти колонии стали больше и образовали плотные колонии. Первое прохождение было выполнено через две недели после первоначального покрытия, а на более поздних проходах кератиноциты демонстрировали стабильный рост с более коротким периодом культивирования. Кератиноциты переставали расти, если во время процесса выделения происходило значительное загрязнение фибробластами.
После культивирования в кератиноцитах экспрессируется кератин 14 и альфа6-интегрин. Клетки раннего и позднего прохождения показали равномерную экспрессию P63, подтверждающую их стволовую способность. Тем не менее, кератиноциты, обработанные высоким содержанием кальция, показали снижение экспрессии P63, что указывает на то, что лечение высоким содержанием кальция подавляет гены, связанные со стволовыми клетками.
Маркер дифференцировки кератина 13 показал редкую экспрессию или отсутствие в ранних и поздних проходах, но значительную экспрессию при лечении высоким содержанием кальция. Маркер фибробластов PDGFR альфа не экспрессировался в культуре кератиноцитов, что указывает на то, что этот протокол может успешно выделять базальные кератиноциты и поддерживать эти клетки в недифференцированном состоянии. Улавливание должно начинаться с эпидуральной стороны и 10 минут на образец ткани.
Кроме того, как правило, пипетирование клеток важно для лучшей жизнеспособности клеток. После двух-трех проходов оральный кератиноцит становится стабильным для дальнейших функциональных экспериментов. Важно отметить, что этот протокол может быть объединен с трансгенной жизнью мыши для клеточного и молекулярного анализа in vitro.
Недавние исследования сообщили о динамике и гетерогенности пероральных базилярных стволовых клеток. Этот метод облегчит изучение биологии стволовых клеток полости рта и приведет к лучшему пониманию заболеваний полости рта.
